La quinina: una molécula maravillosa

 

Molécula de la quinina. Fuente

La quina fue descubierta por Pedro Leiva, en Malacatos, Loja, Ecuador en 1630. La quina era un tratamiento eficaz contra la malaria malaria, producida por el protozoo parásito Plasmodium falcifarum, el cual no existía en América y que probablemente se introdujo en el continente desde África, continente endémico para esta enfermedad. Esto indica que el descubrimiento de Pedro Leiva no se trata de un conocimiento ancestral ya que esta enfermedad, cuando empezó a afectar las tierras de Loja, era una enfermedad reciente en tiempos de Pedro Leiva.

En el año 2000 publiqué mi primer trabajo sobre fluoroquinolonas:

y en 2023 he seguido publicando con esta molécula

Aunque la quinina ha sido reemplazada por la artemisina, la cloroquina todavía se usa con éxito para tratar malaria.

Video 1: Chloroquine & Hydroxychloroquine | Mechanism of Action, Targets (Malaria), Adverse Effects

Práctica PCR región ITS de Candida albicans

Descarga la práctica en tu celular

Introducción

Objetivos de la práctica

Realizar el montaje experimental de la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR). Conocer el fundamento teórico y las aplicaciones de la reacción de PCR.

Alcance

Esta práctica de laboratorio comprende el ensamblaje de la reacción de PCR y el corrimiento de la misma en un termociclador, el DNA resultante, amplicones, se almacenará para su visualización en gel de electroforesis en la siguiente práctica.

Requisitos previos a la realización de la práctica

Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá realizar una lectura sobre el fundamento teóricoectura sobre el fundamento teórico de la reacción en cadena de la Polimerasa y la guía de práctica. Al inicio de la práctica se realizarán preguntas acerca de las lecturas.

Video 1: en las células la duplicación del ADN es un proceso complejo en el que toman parte muchas enzimas. En la PCR, la duplicación es extremadamente sencilla y la única enzima responsable del proceso es la Taq polimerasa

Materiales

Antes de empezar la práctica tenemos que tener todos los materiales, como se observa en la fotografía. Los reactivos tienen que estar en una gradilla térmica a baja temperatura

Tenemos el buffer + dNTPs + Taq polimerasa alicuoteados en tubos eppendorf

Método

Reacción para 1 tubo de PCR:

Primer 1                            1.25 ul

Primer 2                            1.25 ul

Buffer+dNTPs+Tag 2x        

dH20

Total                                    23 ul

Se le añade 2 ul de ADN

Como vamos a hacer 1 muestra tenemos que tener, además de esta muestra, un control positivo con ADN de Candida albicans y un control negativo con agua destilada. Para evitar el exceso de pipeteo hacemos un Mix multiplicando la reacción para 1 tubo x 3.5

Programa DITS 

95º 5min

35 ciclos

94º 1m

51º 1 min 20 seg

72º 1m

Cuando acaben lo 35 ciclos hay un paso adicional

72º 10min

Y luego el termociclador mantiene las muestras a 10ºC

Primers

ITS1 5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´

ITS4 5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´

Secuencia ITS4 reversa 5´GCATATCAATAAGCGGAGGA 3´

The DNA fragment amplifed with these primers includes the 5.8 subunit and two intergenic spacers of ribosomal DNA.

>LC601821.1 Candida albicans IFM 4953 genes for 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA, partial and complete sequence

TGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGATTTGCTTAATT
GCACCACATGTGTTTTTCTTTGAAACAAACTTGCTTTGGCGGTGGGCCCAGCCTGCCGCCAGAGGTCTAA
ACTTACAACCAATTTTTTATCAACTTGTCACACCAGATTATTACTTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGG
ATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGT
GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGT
TTCTCCCTCAAACCGCTGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGACTTGGGTTTGCTTGAAAGACGGTAGTGGTA
AGGCGGGATCGCTTTGACAATGGCTTAGGTCTAACCAAAAACATTGCTTGCGGCGGTAGCGTCTACCACG
TATATCTTCAAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAG
GAA

Tamaño del fragmento ampliado 537 nt

Visualización de la PCR: electroforesis en gel de agarosa

En vez de TBE nosotros vamos a utilizar un buffer similar: TAE. 

El colorante que va a teñir en la electroforesis de agarosa, al final del protocolo, es SYBR Green de Invitrogen. El DNA Ladder BenchTop 100 bp es de Promega

Referencias:

Identification of Candida Species by PCR Identification of Candida Species by PCR

Evaluation of internal transcribed spacer region of ribosomal DNA sequence analysis for molecular characterization of Candida albicans and Candida dubliniensis isolates from HIV-infected patients

Ejercicios:

EJERCICIO 1:  ¿Por qué cuando preparamos el master mix y añadimos la Taq polimerasa no mezclamos utilizando el vortex?

EJERCICIO 2:  ¿De qué depende la temperatura de annealing o unión de los primers? Explique. 

EJERCICIO 3: ¿Qué ocurre cuando utilizamos una temperatura de anillamiento 20 ° C menor de la temperatura de anillamiento recomendada?

EJERCICIO 4:  ¿Por qué es recomendable usar material nuevo y estéril para PCR? ¿Qué tipo de consecuencias podríamos tener? Pon un ejemplo.

EJERCICIO 5:  Si hacemos una amplificación de ADN mediante PCR ¿Cuál será el control negativo y cuál el positivo?

EJERCICIO 6: Tengo que preparar un master mix siguiendo la siguiente receta: 

Master mix (volumen final por tubo de reacción = 50 ul)

Ingrediente/tubo                                                                                             Cantidad/tubo

    Taq                                                                                                                        0,2 ul

    MgCl2                                                      50mM                                                  1   ul

    dNTPs                                                      10mM                                                  2   ul

    Primers                                                     10µM                                            2   ul c/ primer

    Tampón de reacción                                 10X                                                      5   ul

    Agua bidestilada o ultrapura                                                                             35,8 ul

Sin embargo, es imposible coger un volumen de 0.2 ul porque las pipetas grises, las que se emplean para volúmenes pequeños sólo pueden trabajar entre 0.5 ul y 10 ul, siendo el menor volumen que pueden tomar con cierta precisión 0.5 ul. ¿Cómo resuelves este problema?

EJERCICIO 7: Tenemos que hacer un gel de agarosa de 200 ml. Tenemos que añadir SYBR Green. El stock de SYBR es 10.000X. ¿Cuántos ul (microlitros) de SYBR tenemos que añadir a la agarosa?

Solución: 2O ul (microlitros)

EJERCICIO 8: Tenemos 25 ul de una PCR. ¿Cuánto Blue Juice 10x tengo que añadir? a) para un volumen final de 20 ul b) para un volumen final de 30 ul

EJERCICIO 9: Hemos hecho un gel de agarosa de 200 ml. Cuando vamos a ponerlo en la cubeta nos damos cuenta de que otro grupo la está utilizando. Ya no hay cubeta grande, solo hay una cubeta pequeña y nuestro gel no entra porque es demasiado grande. ¿Qué hacemos? a) Les rompemos la cabeza y les robamos la cubeta. Aprovechamos para echarle la culpa de la agresión a uno de los compañeros que no vino hoy a la práctica b) Si hay una cubeta más pequeña cortamos el gel para que quepa c) entro en negación y me da un ataque de ansiedad y lloro. Esa circunstancia de estrés psicológico hace que no pueda realizar la práctica por un problema médico. Presento un certificado médico y arreglado. Señala la opción correcta

Solución: 

EJERCICIO 10: Analiza por qué no ha salido nada en estos dos geles de agarosa de PCRs. En cada gel se cargaron 4 muestras: DNA ladder, muestra PCR + a partir de un ADN de Candida conocido, PCR - de agua destilada y nuestra muestra clínica problema. ¿Por qué no se ve ni siquiera el DNA ladder? Nota: si has hecho este ejercicio, el ejercicio 11 te sorprenderá

EJERCICIO 11: Se hizo una PCR, cargó en un gel (A), con el transiluminador del laboratorio de prácticas no se vio nada (B). Esto nos hizo pensar ¿Y si ese transiluminador no es lo suficientemente potente para poder visualizar el ADN? No habíamos comprobado que el transiluminador funcionaba bien, por eso, utilizamos el transiluminador del laboratorio de ómicas. Gracias a este aparato pudimos obtener el resultado (C). ¿Qué se ha aprendido de este proceso?

EJERCICIO 12: Hemos cargado este gel de agarosa ¿Es correcta la orientación? Razona tu respuesta

EJERCICIO 13: Tenemos 25 ul de una PCR. ¿Cuánto Blue Juice 10x tengo que añadir? a) para un volumen final de 20 ul b) para un volumen final de 30 ul

EJERCICIO 14: ¿Qué reactivos se necesitan para una PCR? Imaginemos que tienes que amplificar una región del genoma de Candida albicans

EJERCICIO 15: ¿Qué ocurre cuando utilizamos una temperatura de anillamiento 20 ° C menor de la temperatura de anillamiento recomendada?Pregunta 5:
a) Identifica el ORF en esta secuencia de ADN
5' TATGTTTTATAAAGTCGGATATCTAACCCTTGTCACGTATTTCATGCGCGATGG 3'
¿Cuántos nucleótidos totales tiene ese ORF?

EJERCICIO 15: ¿Por qué es necesario poner la marca de los aparatos que estamos utilizando en la práctica? Por favor, relaciona con la imagen de la pregunta 1

EJERCICIO 16: Quiero hacer un gel de agarosa de 150 ml. ¿Cuánto SYBR green tengo que añadir teniendo en cuenta que está a una concentración 10.000X?

EJERCICIO 17: Tenemos que hacer tres PCRs: dos controles, unos positivo y otro negativo y la muestra que queremos amplificar. Para evitar el pipeteo innecesario hago un mix para los tres tubos. ¿Cuánta cantidad de cada producto tengo que añadir?

Mix (Buffer, dNTPs, Taq polimerasa) 2X 12.5 ul

Primer 1 1.25 ul

Primer 2 1.25 ul

dH2O 8 ul

-------------------------

23 ul

A esto se le añade 2 ul de la muestra

EJERCICIO 18: ¿Por qué bajamos la temperatura del termociclador para que se produzca el anillamiento? ¿Por qué la subimos a 72º en la fase de elongación o polimerización?

EJERCICIO 19: ¿En qué consiste un marcador de peso molecular para cromatografía de agarosa?

Ejemplo de respuesta incorrecta: "Es un marcador que nos permite visualizar el resultado dentro de este gel ya que lo marca este se lo incluye en la mezcla para posteriormente una vez ya finalizado el proyecto podamos identificar la muestra".

Solución: el marcador de peso molecular o "DNA ladder" en inglés, es un producto que tiene fragmentos de ADN de distinto peso molecular. Se carga siempre un pocillo del gel de agarosa con 5-10 ul de este DNA ladder. Cuando encendemos la corriente, el ADN de la electroforesis se mueve hacia el polo positivo. Los ADNs de distinto tamaño del DNA ladder comienzan a separarse dependiendo de su paso molecular. 

Esto permite tener un control de tamaño de ADN para nuestra muestra. 

En el ejemplo, arriba, vemos como la banda correspondiente a nuestra muestra está entre los 500 pb y los 182 pb. Si teóricamente nuestro ADN tendría que medir 191 pb, entonces lo que observamos en el gel arriba es plausible y por tanto entendemos que nuestra PCR es correcta.

EJERCICIO 20:   Hacemos un gel de agarosa. Hay dos posibilidades a la hora de poner el gel en la cubeta. ¿Hacia dónde se orientarán los pocillos? ¿A o B? Fíjate en la posición de los electrodos. Razona tu respuesta desde un punto de vista químico

EJERCICIO 21: hacemos un master mix para 1 tubo de PCR: 

Ingrediente/tubo                                                                                             Cantidad/tubo

    Taq                                                                                                                        0,2 ul

    MgCl2                                                      50mM                                                  1   ul

    dNTPs                                                      10mM                                                  2   ul

    Primers                                                     10µM                                            2   ul c/ primer

    Tampón de reacción                                 10X                                                      5   ul

    Agua bidestilada o ultrapura                                                                             35,8 ul

(volumen final por tubo de reacción = 50 ul)

Sin embargo, es imposible coger un volumen de 0.2 ul porque las pipetas grises, las que se emplean para volúmenes pequeños sólo pueden trabajar entre 0.5 ul y 10 ul, siendo el menor volumen que pueden tomar con cierta precisión 0.5 ul. ¿Cómo resuelves este problema?

Solución: no tenemos pipetas que midan 0.2 ul. Sin embargo, para poder decir que una PCR es positiva o negativa tenemos que hacer paralelamente, además de la muestra clínica, dos controles. Por eso mismo, tenemos que hacer tres PCRs: la de la muestra clínica y el control positivo y el negativo. Lo que hacemos es multiplicar lo que tenemos que añadir a 1 tubo x 3.5. Así haremos un mix para tres tubos de PCR. Siempre se pone un poco más, en vez de x 3 empleamos x 3.5 para que sobre y no que falte ya que hay líquido que siempre se queda adherido a las puntas de las pipetas.

EJERCICIO 22: ¿Por qué el buffer de carga tiene glicerol? ¿Qué ocurre si cuando preparamos buffer de carga no le añadimos glicerol? ¿Para qué tiene colorante el buffer de carga?

EJERCICIO 23: Tenemos que preparar 800 ml de TAE 1X a partir de un stock de TAE 50X ¿Cómo lo harías?

EJERCICIO 24: Analiza el siguiente gel... A) ¿Se han olvidado de poner el DNA Ladder? ¿Se han olvidado de poner SYBR green? ¿Han añadido agua en vez de TAE 1X a la agarosa? ¿Ha funcionado el control + de la PCR? Por tanto, ¿Cuál es tu análisis de este gel?

EJERCICIO 25: ¿Por qué el buffer de carga tiene glicerol? ¿Qué ocurre si cuando preparamos buffer de carga no le añadimos glicerol? ¿Para qué tiene colorante el buffer de carga?

EJERCICIO 26:  A)Blue juice, DNA Ladder y SYBR green ¿Qué función tiene cada uno? B) El SYBR green tiene una concentración de 10.000X. Si tenemos que hacer un gel de agarosa de 150 ml ¿Cuánto SYBR green tenemos que añadir?

El problema de la toxicidad de los antiparasitarios

La parasitología debería de estudiar las interacciones con características de dependencia, como lo es el parasitismo. Existen virus parásitos, como los herpes, bacterias parásitas como Mycobacterium tuberculosis. Los virus y bacterias parásitas se estudian dentro de la virología y la bacteriología respectivamente. Por ese motivo, la parasitología se ocupa principalmente de parásitos invertebrados como protozoos, anélidos y artrópodos. Al trabajar con organismos basados en células eucariotas, los antiparasitarios también tienen un efecto tóxico sobre las células humanas. Por ese motivo, debemos de tener en cuenta la toxicidad del producto a la hora de administrarlo.

Caso clínico:

Tomás se fue de vacaciones a California por tres semanas. Durante su estancia, se percató que los mosquitos eran muy agresivos y pululaban a su alrededor continuamente. Motivo por el cual, le preocupó mucho el contraer el virus de la fiebre del Nilo occidental.

Tomás decidió comprar un repelente para mosquitos que contenía DEET como ingrediente activo. Se roció el repelente en la piel diariamente, reaplicándoselo cada dos o tres horas. En muchas ocasiones, después de aplicárselo en los brazos y las piernas, se vistió con pantalón y camisa de manga larga cubriendo las áreas tratadas con el repelente.

Después de dos semanas de usar el repelente de esta manera, notó una sensación de hormigueo y picazón en su piel. Al final de sus vacaciones, le aparecieron llagas y ampollas en los brazos y piernas. Cuando volvió a casa, se preguntó si las erupciones en su piel habían sido causadas por el uso del repelente. Tomás busco más información en el Internet, encontrando la página web del Centro Nacional de Información de Pesticidas y decidió llamarles.

Tomás aprendió que aplicaciones repetidas e indebidas, así como exposiciones prolongadas a un repelente con DEET podrían causar sensaciones de hormigueo, descamación e irritación en la piel. En algunos casos, la sobreexposición ha causado dermatitis y empeorado condiciones medicas preexistentes de la piel.

El especialista de NPIC le explicó a Tomás que el repelente puede ser aplicado directamente en su piel o encima de la ropa; pero no debe ser aplicado debajo de o estar cubierto por ropa. Más aún, las instrucciones indicaban "evite el uso en exceso del producto" y que este proporciona "hasta 6 horas de protección." Para prevenir exposiciones prolongadas, la etiqueta indica "lave la piel tratada con agua y jabón después de regresar al interior". Fuente

Para valorar la toxicidad de los pesticidas y antiparasitarios importa la dosis y también el peso del organismo sobre el que se administra. A mayor masa corporal mayor capacidad para eliminar metabólicamente el producto.

 Fig.1. La Dosis Letal Media (Median Lethal Dose) se suele abreviar como MLD50, o llamada solo "dosis letal, 50% (DL50)". Es una medida de la toxicidad aguda de una sustancia química. Se define como la cantidad de una sustancia que, cuando se administra a un grupo de animales de prueba, causa la muerte del 50% de ellos dentro de un período de tiempo determinado, generalmente 24 h. Fuente

LD50 y LC50

LD50 (Dosis Letal 50%) es una dosis derivada estadísticamente en la que se espera que muera el 50% de los animales. Para la toxicidad por inhalación, se utilizan las concentraciones en el aire como valores de exposición. Por lo tanto, se utiliza la LC50 (Concentración Letal 50%).

El LD50 y el LC50 se obtienen típicamente de estudios de toxicidad aguda. Las unidades de LD50 y LC50 se enumeran de la siguiente manera:

LD50: mg/kg p.c. mg/kg p.c./día significa miligramos de sustancia por kilogramo de peso corporal administrados por día.

LC50: mg/L. mg/L es la concentración de aire estimada de una sustancia administrada por vía de inhalación. A veces se usa ppm.

EJERCICIO 1: ¿Qué valor de LD50 indica una mayor toxicidad aguda? Razona tu respuesta

Fig. 2.

Respuesta: Un valor más bajo de LD50/LC50 indica una mayor toxicidad aguda.

NOAEL

El Nivel Sin Efecto Adverso Observado (NOAEL) es el nivel máximo de exposición en el que no hay aumentos biológicamente significativos en la frecuencia o gravedad de los efectos adversos entre la población expuesta y su grupo de control apropiado; algunos efectos pueden producirse a este nivel, pero no se consideran efectos adversos.

Los NOAEL se obtienen típicamente de estudios de toxicidad de dosis repetidas (estudio de toxicidad de dosis repetidas de 28 días, estudio de toxicidad de dosis repetidas de 90 días o toxicidad crónica) y estudios de toxicidad reproductiva. Los NOAEL son muy importantes. Se utilizan para derivar dosis de exposición segura para los seres humanos, como el nivel derivado sin efecto (DNEL), el límite de exposición ocupacional (OEL) y la ingesta diaria admisible (ADI).

Las unidades de NOAEL son mg/kg p.c./día o ppm para las vías dérmica y oral. Para la vía de inhalación, se utiliza NOAEC en su lugar. La unidad puede ser mg/L/6h/día.

Un NOAEL o NOAEC más alto indica una menor toxicidad sistémica o una menor toxicidad crónica.

LOAEL

El Nivel Más Bajo de Efecto Adverso Observado (LOAEL) es el nivel de exposición más bajo en el que hay aumentos biológicamente significativos en la frecuencia o gravedad de los efectos adversos entre la población expuesta y su grupo de control apropiado.

A veces, solo se puede obtener el LOAEL de los estudios de toxicidad de dosis repetidas (estudio de toxicidad de dosis repetidas de 28 días, estudio de toxicidad de dosis repetidas de 90 días o toxicidad crónica) y los estudios de toxicidad reproductiva debido al diseño del estudio. Si no se pueden identificar los NOAEL, también se utilizan los LOAEL para derivar la dosis de exposición segura para los seres humanos, como el nivel derivado sin efecto (DNEL). Sin embargo, se deben aplicar factores de evaluación más altos.

La imagen a continuación muestra la relación entre LD50, LOAEL, NOAEL y DNEL en una curva dosis-respuesta típica.

Eficacia versus letalidad

Dosis efectiva: La dosis que produce el efecto deseado en el 50 % de la población se conoce como dosis efectiva 50% o ED50. Puede ser graficado en la Curva dosis-respuesta como la mitad de la concentración de fármaco necesaria para alcanzar la eficacia máxima.

Fig. 3 Margen de seguridad

La eficacia es la capacidad que tiene un fármaco para matar al 100% al microorganismo que esté causando enfermedad. Tiene que ser menor a la letalidad de ese mismo fármaco en animales de experimentación. Cuanto menor mejor. El márgen de seguridad es la distancia entre la ED50 y la LD50.

Linearizar curvas sigmoideas

Para poder obtener información relevante es necesario linearizar las curvas sigmoideas, lo cual se consigue expresando la dosis en el eje de abscisas de forma logarítmica. 

Fig. 4 Características curva sigmoidea. Fuente

Video 1: Transformar datos no lineales para aplicar regresiones linealesTransformar datos no lineales para aplicar regresiones lineales | Khan Academy en Español

Video 2: 46. Cómo calcular la PENDIENTE en ExcelCómo calcular la PENDIENTE en Excel

A partir de esta curva dosis-respuesta lineal se puede calcular la DL50 y la pendiente de la recta, que son los dos parámetros que podemos utilizar para comparar la toxicidad de dos sustancias diferentes.

Fig. 5. Linearizar una curva sigmoidea. Fuente

a) La determinación de la DL50 suele ser el primer experimento realizado con un producto químico nuevo. La DL50 se obtiene trazando una línea horizontal desde el 50% de mortalidad (en el eje de ordenadas) hasta la línea dosis-efecto. En el punto de intersección se traza una línea vertical que corta al eje de abscisas en un punto que corresponde a la DL50. De forma similar se podrían calcular las dosis letales para el 90% y 10% de la población (DL90 y DL10), pero en estos extremos de la curva el rango de valores determinados por los límites de confianza es mayor, aumentando la incertidumbre (inexactitud) del valor.

b) A partir de esta representación gráfica, puede obtenerse también la pendiente de la recta, que sirve para comparar la toxicidad de dos o más compuestos entre sí: a mayor pendiente mayor toxicidad. Pero la DL50 no es una constante biológica y de hecho son muchos los factores que pueden influir en su valor: raza, edad, peso, alimentación, método de administración, volumen y tipo de suspensión, duración de la observación, etc. Debido a la variabilidad inherente a la DL50 se admite en la actualidad que en general es suficiente con dar el valor con un rango de magnitud como por ej. de 5 a 50 mg/Kg, 50 a 500 mg/Kg, etc.

EJERCICIO 2: ¿Cuál de los dos productos b y c presentan mayor toxicidad y por qué? b ¿Qué producto es más tóxico a o c?

EJERCICIO 3: Interprete el gráfico adjunto relacionado con enzimología (aclarando el significado de las letras: A, B, c, d). ¿Hay algún paralelismo con los gráficos de estudio de toxicidad?

¿Cómo se pueden relacionar esta gráfica con el siguiente diagrama?

Solución: En la mayoría de las reacciones enzimáticas, la velocidad inicial va aumentando en función de la concentración de sustrato, hasta aproximarse de manera asintótica a un valor máximo. Se observa que, en la llamada “zona de saturación”, el incremento de V es apenas significativo por mucho que aumente [S].

A = velocidad máxima.

B = zona de saturación

C = constante de Michaelis-Menten (KM), es decir, la concentración de sustrato que se corresponde con la mitad de la velocidad máxima (D).

En los estudios de toxicidad las gráficas son similares porque hacen referencia a la interferencia entre la toxina y la enzima vital para el organismo.

EJERCICIO 4: Estas dos gráficas de toxicidad sobre el parásito Leishmania brazilensis, de los compuestos A y B. En abscisas (eje X) la concentración de un fármaco en mg/ml, en ordenadas (eje Y) el porcentaje de parásitos muertos. ¿Qué dos diferencias puedes observar entre el compuesto A y el B?

EJERCICIO 5: Frente a un parásito, sensible a un antiparasitario de primera generación y sensible a uno de última generación ¿Cuál sería tu opción terapéutica y por qué?

EJERCICIO 6: De forma sucinta ¿Por qué no es tan problemática ingerir una concentración alta de antibiótico comparado con la ingesta de un antiparasitario?

EJERCICIO 7: Esta es una típica gráfica dosis/respuesta. Se trata con Dalvabancina a la bacteria Staphylococcus haemolyticus y con Anidulafungina a Candida albicans, en el eje de abscisas (eje X) por separado (datos de las dos columnas de la izquierda). Cuando se crecen juntas (las dos columnas de la derecha) la bacteria y el hongo (biofilms polimicrobianos) vemos que cuando se trata a S. haemolyticus con dalvabancina (en rojo) se obtiene unos porcentajes de letalidad, cuando se trata a la Candida albicans con anidulafungina se obtienen otros. 

a) ¿Qué significan los subíndices 50, 80 y 90? Razona tu respuesta

b) b) ¿Por qué los resultados de la dalvabancina son los mismos cuando se administra a la bacteria S. haemolyticus creciendo sola (a la izquierda) o creciendo juntamente con Candida albicans (a la derecha)? 

c) C) ¿Por qué los valores para Candida albicans varía de cuando se le administra el antifúngico anidulafungina creciendo sola (a la izquierda) a cuando crece en presencia de S. haemolyticus?

d) ¿Por qué no se prueba el efecto de la anidulafungina en S. haemolyticus y no se prueba dalvabancina en Candida albicans?

Solución: copio literalmente la respuesta de una alumna que ya está al nivel del profesor :)

a) Subíndice50 = concentración inhibitoria al 50%, el la dosis necesarias para inhibir el 50% de la población microbiana. Subíndice80 = concentración inhibitoria al 80%, es la dosis necesaria para inhibir el 80% de la población microbiana. Subíndice 90 lo mismo para el 90% de la población. Nótese que es necesario más concentración de antimicrobiano para matar el 90% que para matar al 50%, como es lógico. Estos valores se utilizan para cuantificar la eficiencia de un tratamiento antimicrobiano.

b) La dalvabancina es un antibiótico específico contra la bacteria Gram positiva S. haemolyticus. Cuando se administra en el entorno polimicrobiano en donde está en presencia de C. albicans, el mecanismo de acción del antibiótico no se ve afectado por la presencia del hongo. Esto lo que indica es que la dalvabancina, de alguna manera, no tiene interferencia significativa por parte de C. albicans.

c) La variación de los valores de letalidad de Candida albicans cuando se administra anidulafungina en presencia de S. haemolyticus puede deberse a varios factores: 

    1. Interacciones microbianas = la presencia de la bacteria puede afectar el entorno microbiano y las condiciones de crecimiento y esto influye en la eficiencia del antifúngico.

    2. Producción de metabolitos. La bacteria podría producir metabolitos que alteren la permeabilidad de la biopelícula o la susceptibilidad de C. albicans a la anidulafungina

    3. Estructura de la biopelícula: la estructura de la biopelícula afecta a la difusión y la concentración local del antígeno.

d) No se prueba el efecto de la anidulafungina en S. haemolyticus ni la dalvabancina en C. albicans porque estos fármacos son específicos para hongos y bacterias respectivamente, es decir, antifúngicos no atacan las moléculas bacterianas ni los antibióticos las moléculas de los hongos.

EJERCICIO 8: La ruda: se usa como antiparasitario, antirreumático, para tratar problemas digestivos, para el “mal de ojo”...  Entre sus componentes esta una molécula perteneciente a la familia de las quinolonas. Se aísla esta molécula y cuando se le añade, por síntesis orgánica, un átomo de cloro se observa un que el Nivel Más Bajo de Efecto Adverso Observado (LOAEL) de esta molécula es A. Cuando se le añade, en vez de cloro, un átomo de fluor se observa que el LOAEL se sitúa en el punto B

Gráfica dosis-respuesta:

Eje X: Dosis de la sustancia, eje Y: Respuesta biológica o toxicológica

a) ¿Cuál consideras que sería mejor medicamento humano A o B y por qué?

b) ¿Se podría modificar las moléculas para que su LOAEL sea más bajo? ¿Cómo?

c) ¿Existe diferencias en la DL50 entre la cloro-quinolona y la fluoro-quinolona? ¿Por qué?

Solución: 

a) A, porque el Nivel Más Bajo de Efecto Adverso Observado (LOAEL) es el nivel de exposición más bajo en el que hay aumentos biológicamente significativos en la frecuencia o gravedad de los efectos adversos entre la población expuesta y su grupo de control apropiado. Un LOAEL más alto indica una menor toxicidad sistémica o una menor toxicidad crónica

EJERCICIO 9:  La siguiente gráfica dosis /respuesta. Eje X: Dosis de la sustancia. Eje Y: Respuesta biológica o toxicológica. 

EJERCICIO 10:  Eje X: Dosis de la sustancia. Eje Y: Respuesta biológica o toxicológica

Tenemos dos productos A y B. Ambos comparten la misma curva dosis/respuesta. El producto A tiene un Nivel Sin Efecto Adverso Observado (NOAEL) representado en el punto situado en la A de la gráfica. El NOAEL del producto B está representado por la letra B en la gráfica 

a) ¿Cuál consideras que sería mejor medicamento humano A o B y por qué?

b) ¿Se podría modificar las moléculas para que su NOAEL sea más bajo? ¿Cómo?

EJERCICIO 11: La ivermectina es un antiparasitario eficaz frente a numerosos nematodos, así como frente a ectoparásitos de diversas especies animales. Este compuesto tiene un amplio margen de seguridad en cerdos, éste es al menos 10 veces la dosis terapéutica.  A) Imaginemos que la LD50 para un cerdo es de 30 ug/Kg si la ED50 es 10 veces menor ¿Cuánto equivale la ED50?

B) En la gráfica podemos ver como la eficacia al 99% corta la curva dosis/respuesta de letalidad en animales de experimentación (imaginemos un cerdo como animal de experimentación). ¿Cómo se podría definir ese punto de corte? ¿NOAEL, LOAEL? Razona tu respuesta

Solución: A) la décima parte de algo es ese algo dividido por diez, por tanto 3 ug/Kg B) Si la ED99 corta a la curva de dosis respuesta de la LD50 quiere decir que a esa concentración ya está produciendo daño en los animales de experimentacicón, por lo tanto NOAEL no va a ser, entones será LOAEL

Para saber más:

Ejercicios enzimas

Comparativa parásitos intestinales

 

Para saber más

Sal de ajo y los controles positivo y negativo

¿Cómo podríamos poner un control positivo y otro negativo a este experimento?

Si sembramos bacterias en una placa Petri y en el centro añadimos sal de ajo veremos que tiene propiedades antimicrobianas. Pero este experimento es inexacto si no comprobamos la actividad antimicrobiana con dos controles, uno positivo y otro negativo

Placa Petri con bacterias, sal de ajo en el centro rodeado de un halo de inhibición. Fuente Microbioblog

Variación, selección y expansión clonal (El libro)

 

     Fig. 1. Selección clonal, Paso-1. Durante su desarrollo a partir de una célula madre se genera una variación de linfocitos. Cada linfocito B se programa genéticamente, a través de un proceso llamado translocación génica, para hacer un receptor de células B único. Las moléculas de ese receptor de células B se colocan en su superficie donde puede reaccionar con epítopos de un antígeno. Fuente

 Fig. 2. Expansión clonal. Las citocinas de un linfocito T4 efector ahora permiten que el linfocito B activado prolifere en un gran clon de linfocitos B idénticos. Durante este tiempo, el “ajuste fino” del receptor de células B se produce a través de la maduración por afinidad. Fuente

Resistencia a antibióticos

Evolución cultivo bacteriano

http://bacteriasactuaciencia.blogspot.com/2023/02/evolucion-de-un-cultivo-diluido-11000.html

Diluciones estrías por agotamiento

PCR y PCR tiempo real

Práctica PCR clásica

Práctica isoterma Porphyromonas

https://bacteriasactuaciencia.blogspot.com/2022/11/practica-pcr-tiempo-real.html

https://bacteriasactuaciencia.blogspot.com/2022/11/practica-pcr-lamp.html

Vacunas

http://bacteriasactuaciencia.blogspot.com/2023/02/para-entender-las-vacunas-debemos-de.html

http://bacteriasactuaciencia.blogspot.com/2023/02/para-entender-las-vacunas-debemos-de.html

CAR-T

http://bacteriasactuaciencia.blogspot.com/2023/03/la-inmunoterapia-con-cart-redefine-lo.html

Colon irritable

Ojos azules

La expansión clonal revienta a la bacteria hospedadora: Experimentos de bursts con bacteriófagos

Árboles genealógicos invertidos

Una de las características de los árboles genealógicos es que a medida que te vas distanciando del origen vas "diluyendo" la materia original. Esa dilución ocurre por la variación genética que origina el intercambio sexual o por mutaciones. 

Los árboles genealógicos no son una invención de Darwin. En la Edad Media

https://actuaciencia.blogspot.com/2023/01/arbre-ordo-arboles-genealogicos-de-las.html

Se puede hacer un cálculo del porcentaje de material genético en común con las distintas generaciones que nos han precedido. Esta "dilución" se puede visualizar en un experimento sencillo de Diluciones seriadas

Cómo medir la variación celular por citometría

Esta práctica consiste en entender las gráficas que se obtienen por citometría

Prueba de la toxoplasmosis

 Control serológico de la embarazada para la prevención de la toxoplasmosis

Alerta por Anisakis

La Unión Europea ha emitido una alerta sanitaria «grave» por la presencia de anisakis en unas huevas de merluza que se venden en supermercados en España procedentes de Marruecos. El Sistema de Alerta Rápida para Alimentos y Piensos de la Unión Europea (Rasff) ha informado que se ha detectado el parásito en un lote de pescado durante un control fronterizo, por lo que se ha ordenado su retirada de inmediato. El organismo desconoce si otras remesas han podido eludir los controles y llegar al mercado español, de forma que se pide a la población que no las consuma.

Fig. 1 Anisakis es un nemátodo parásito de peces

La Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición (Aesan) «obliga a que los productos de la pesca no se pongan a la venta con parásitos visibles». De sobra es conocido que la merluza o las anchoas, entre otros, contienen este parásito, que provoca afecciones digestivas de carácter grave. En teoría, una persona sólo puede contraer si come pescado infectado sin cocinar o sometido a preparaciones que no matan al parásito, por lo que se recomienda congelarlo previamente.