¿Qué ocurre en nuestras narices?:Análisis de microarrays en biofilms de Neisseria

Tratan de establecer si los biofilms de Neisseria meningitidis crecidos, en un aparato de cultivo continuo “sorbarod” o en cultivo estático, podrían mimetizar a los biofilms que se forman y colonizan el epitelio humano.

Se utilizó un microarray de dos colores en donde se marcó con Cy3 el DNA genómico de una cepa tipo de N. meningitidis.

Por resultados previos los autores sospechan que tiene que haber una represión de los genes responsables de la producción de los azucares (LOS) que rodean la membrana externa de la célula para que se forme el biofilm.

Trabajan con dos cepas, una cepa tipo y una cepa mutante para la formación de LOS y las hacen crecer en dos tipos de cultivos, con flujo de nutrientes y en cultivo estático. Comprueban que se forman biofilms en estos cultivos por tinción violeta cristal y cuantificando con un espectrofotómetro. De esta manera se igualan las muestras. Posteriormente se extrae mediante un kit comercial el RNA. Las muestras de RNA se cuantificaron con el Nanodrop y se confirmaron mediante electroforesis. Se marcó el RNA y el DNA. El microarray se hizo siguiendo el protocolo disponible en la página del grupo de Microarrays bacterianos ( BµG@S) http://bugs.sgul.ac.uk/bugsbase/tabs/array.php?design_id=24&action=designs

Cada array se co-hibridó con una de las muestras problema marcadas con Cy5 y con el DNA genómico de la cepa tipo (control universal). Los microarrays se escanearon con GenePix-4000B y se analizaron con GenePix Pro 6.0. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con Genespring GX 7.3. Los ratios log-transformados fueron normalizados por la técnica de LOWESS usando un 20% de los datos para suavizar.

Los datos recolectados a partir de 5 réplicas del mismo experimento se trataron de la siguiente forma: los ratios log-transformados de las muestras recolectadas a las 48h renormalizaron a el valor de la mediana que se calculó de las muestras a tiempo 0, lo que dió un un ratio T48/T0. Los genes expresados diferencialmente se seleccionaron usando un test t-Student con un valor p = 0.01. Los resultados del microarray se validaron utilizando una RT-PCR cuantitativa.

El objetivo de este estudio era hacer un análisis transcripcional de los genes de N. meningitidis en biofilms ya que la bacteria se encuentra en la cavidad nasofaringea como comensal en este estado. Observaron que como sospechaban los genes asociados a la formación de cápsula estaban más reprimidos en los biofilms de la cepa salvaje. El resultado estrella fue observar que los genes que codifican para proteínas que se encuentran en las vesículas de membrana externa (son unas vesículas de entre 50 y 200 nm que se liberan de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas al medio) están sobrexpresadas en los biofilms maduros. Esto es un dato muy interesante porque algunas de estas proteínas son actualmente consideradas los constituyentes más prometedores de las vacunas propuestas para la enfermedad causada por los meningococos serogrupo B.

Referencia:

Meningococcal biofilm growth on an abiotic surface - a model for epithelial colonization?

O'Dwyer CA, Li MS, Langford PR, Kroll JS. Microbiology. 2009 Jun;155(Pt 6):1940-52. 2009  

Esta publicación se ha realizado con un microarray generado por el grupo BµG@S, que es un servicio del The Bacterial Microarray Group at St George's (BµG@S) facility.