Los plásmidos viajan en vesículas de membrana (y transforman especies de bacterias similares)

Os voy a explicar el último artículo científico que hice. Este trabajo fue una de las razones de dejar, al menos temporalmente la ciencia. Cuando ya estaba listo y había hecho todos los controles que me había pedido el que era mi jefe fue entonces cuando me pidió los datos, cepas, plásmidos y protocolos para que se los diese a la técnico para que repitiese de forma independiente mis experimentos. En ese momento dije que me iba y me fui. Repitieron los experimentos, salió todo como había hecho y publicaron. Como veis mi nombre no va de primero ni tampoco soy "corresponding author" lo que viene a ser el "mastermind" que diseñó y pensó el artículo. Este artículo lo diseñé y pensé como continuación a lo que había aprendido sobre vesículas de membrana en la Universidad de Michigan. Luego viene a Coruña y tres años dejaba dejaba el laboratorio. ¿Qué no hay una universidad española entre las 200 mejores? ¿Qué no hay premios Nobel españoles de ciencia exceptuando a Ramón y Cajal?. Valga esta experiencia como un suma y sigue de la explotación de los científicos sin plaza por los ya establecidos en este país sin que nadie diga nada. Si no de que hay personas con tantísimas publicaciones. Hay excepciones claro está, pero son tan excepciones que las conocemos todos. Lo demás es la norma.

La idea básica es coger las vesículas de membrana externa (OMVs en sus siglas  en inglés) de Acinetobacter baumannii y ver si, primero llevan en su interior plásmidos de ADN y después comprobar si estas vesículas son capaces de transformar otras cepas u otras especies de Acinetobacter.

 Las OMVs tienen un tamaño entre 50 y 20 nm como se puede ver en la fotografía de microscopía electrónica de transmisión. Estas vesículas se obtienen básicamente por ultracentrifugación. Primero se crece a la bacteria en un medio rico, se centrifugan estos cultivos para bajar todas las bacterias y se deja el sobrenadante que se filtra a través de filtros de 0.2 micras. Esto elimina a las bacterias que hubiesen quedado en el sobrenadante. Este sobrenadante filtrado es estéril porque si tomamos muestras y las cultivamos en medio líquido o sobre placa Petri no crece nada.

Para obtener las OMVs las ultrifugamos y las obtenemos bien del fondo o si por ejemplo hacemos un gradiente de densidad con sucrosa las obtenemos de la fracción correspondiente a un 30% de glucosa.


Si no os funciona esta presentación de Slideshow podéis verla aquí:

https://drive.google.com/file/d/0B6tsE05fLtm3UXhGX215NWI2ckE/edit?usp=sharing

El siguiente experimento fue una chorrada pero que ilustra cómo la transformación de la cepa sensible de Acinetobacter con OMVs procedentes de cepas clínicas es dependiente del tiempo. Incubamos A. baumannii que ha crecido hasta una OD600 de 0.4 (quiere decir que el cultivo está en fase exponencial, esto es que las células están muy activas metabólicamente) con 10 ug de vesículas y dejamos incubar a distintos tiempos. Luego se siembran en placas Petri y se dejan crecer las placas un día para poder observar colonias. Cuando las células incubaron sólo una hora no vemos colonias transformantes; a las 24 h de incubación se alcanza un máximo de transformantes.. Cuando las células tuvieron 3 h de incubación con las vesículas y luego se sembraron obtvimos un tercio del máximo. Por lo tanto es un proceso dependiente del tiempo en el que se obtienen el 50% de los transformantes a las 6 h de incubación.

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La cepa tipo ATCC 17978 que es sensible a los antibióticos cuando se transforma con el plásmido proveniente de las cépas clínicas a través de las vesículas adquiere la resistencia que exhiben las cepas clínicas.

Hicimos un Dot-blotting para comprobar si la transformacion era dependiente de dosis y para detectar la presencia del gen blaOXA24 en las vesículas de membrana. Para ello se precipita el ADN de las vesículas en una membrana de manera que el ADN de las vesículas se queda pegado a las membranas. Luego se incuba con un líquido en el que hay una hebra de ADN marcada radioactivamente. Este ADN se mueve en el líquido libremente. Si se encuentra con el mismo gen adherido a la membrana se va a hibridar, es decir va a complementar la hebra del ADN pegado a la membrana para así formar una doble cadena de ADN en donde una hebra proviene del ADN que está en las vesículas y la otra hebra del ADN marcado radioactivamente. En el experimento A vemos que el dot (punto en inglés) A es el control positivo, y el F el negativo y funcionan correctamente y que a mayor cantidad de vesículas más ADN hay dentro de la cepa tipo que en principio carece de este gen como se puede observar en F.

En la fila de abajo (B) lo que vemos es que las cepas clínicas A y B tienen el gen  blaOXA24 y la cepa tipo transformada con vesículas provenientes de A y B también, ver dots C y D, mientras que la cepa tipo sola no tiene el gen  blaOXA24: ver dot E.

Para mi el trabajo ya estaba completo pero hay que hacer más para tener contentos a las personas que van a corregir nuestro trabajo y decidir si se publica o no. Ya dije que la preparación de vesículas de membrana era estéril. Si añadías una preparación de vesículas de membrana a medio de cultivo rico y dejabas crecer durante varios días no crecía nada. Aun así había que cerciorarse. No vaya a ser que tengamos muñones en vez de manos. Así que hicimos un experimento REP-PCR, que consiste en amplificar ADN de los plásmidos para tener cantidad suficiente para que al correr en un gel de agarosa se vean esas bandas tan hermosas. Lo que se amplifica son regiones palindrómicas repetitivas del genoma. Dos cepas se consideran que pertenecen a la misma especie cuando tienen el mismo patrón de bandas. Se acepta una diferencia máxima de dos bandas. Vemos que A y B son los patrones de las cepas clínicas y C, D y E pertenecen a la cepa tipo, sóla (C) o transformada a través de las OMVs con los plásmidos provenientes de A y B (los canales D y E). Conclusión: no ha habido contaminación.

Hemos visto que no había contaminación en las células de A. baumannii. Ahora comprobaremos que los plásmidos son los que son y que no hubo contaminación. Se extraen los plásmidos, se cortan con unas enzimas de restricción y se observa su perfil de bandas. 1 y 3 son las bandas de los plásmidos de las cepas clínicas y 2 y 4 son los mismos plásmidos en la cepa tipo. Todo está bien. Artículo publicado.

La conclusión era la que dije al principio: A. baumannii libera vesículas de membrana que en su interior portan plásmidos y algunos de estos plásmidos, como es nuestro caso llevan un gen de resistencia a antibióticos. Estas vesículas pueden transformar otras cepas de A. baumannii.