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miércoles, 23 de abril de 2014

Caracterizando fagos: un fago contra Acinetobacter baumannii (1/2)

Estoy en Barcelona y en vez de estar en la calle disfrutando del Sant Jordi estoy en la habitación del hotel Praktik leyendo un artículo: Isolation and Characterization of a Virulent Bacteriophage AB1 of Acinetobacter baumannii. Hongjiang Yang, Li Liang, Shuxiang Lin and Shiru Jia.

Lo primero que me sorprendió es que sea la primera referencia de fago contra esta bacteria ¡En 2010!. La revista es BMC Microbiology. El impacto de la revista es de 3.1 que está bien. 

El trabajo no es mucha cosa, aislamiento y caracterización del fago. Siete figuras, una tabla y a correr. No parece muy difícil. 

Lo primero que hacen es identificar Acinetobacter baumannii mediante amplificación de genes de ARN ribosómico de la subunidad 16S por PCR y mandarlos a secuenciar. Ahora que sabemos que tenemos A. baumannii utilizamos estas cepas para aislar el virus según procedimientos estandar.

Figura 1. Aislan el ADN del fago y lo cortan con distintas enzimas de restricción. Gracias a esto sabemos que el fago es de doble cadena de ADN porque sino no lo cortarían las enzimas. Que su ADN tiene alrededor de 46 kilobases.
 



Ahora gracias a este sencillo experimento de análisis de fragmentos de restricción podemos caracterizar a nuestro fago.

Microscopía electrónica, figura 2:









Ahora sabemos que nuestro simpático virus pertenece a la familia Siphoviridade.

La figura 3 no nos dice más que el patrón de bandas de proteínas del virus. Tiene 5 bandas predominantes y seis más, de pesos que van de 14 a 80 kDa.




Y ya aquí como dicen los conductores de autobús de todos los lugares del mundo: AAAAAAAAmos que nos vamos!

En este punto el chino que ha hecho el paper está que lo peta. Aaaaamos que nos vamos!


Ahora determina el MOI, es decir la multiplicidad de infección, que no es otra cosa que una relación de virus respecto a la célula a infectar. Por ejemplo: "Añadir el virus a una MOI de 0.5 unidades formadoras de placa por célula" este párrafo quiere decir que si tenemos 10.000.000 de células añadiremos la mitad de virus 5.000.000. El chino del paper comprueba que poniendo 10.000 veces menos virus que células obtiene la mayor cantidad de progenie de fagos, y decide hacer todos los experimentos con esta relación de fagos/bacteria.

Análisis del efecto del calcio en la tasa de absorción del virus:

Por lo visto los iones calcio estabilizan la absorción del fago (esto no lo sabía)



Al principio todos los fagos están en solución. A medida que pasa el tiempo desaparecen asociados a las membranas de las bacterias. Con calcio un poquito mejor. Se ve que algo ayuda. No es para tirar cohetes pero menos da una piedra.

Bueno pues ahora hay que saber cuanto tiempo se queda el virus dentro de la bacteria y cuando la revienta cuantos fagos "hijos" produce.



Lo que dice la gráfica es que el virus revienta la bacteria a los 20 min. y a la media hora ya están todos fuera y que generan sobre 400 virus por cada bacteria reventada.

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