Cómo tomar muestras para el laboratorio de microbiología

Tomar muestras para detectar la presencia de un microorganismo que esté causando enfermedad es un proceso rutinario de los laboratorios de microbiología. Tan rutinario que a veces no tenemos en cuenta las implicaciones que las distintas rutinas tienen. La rutina dice que hay que aislar y crecer la bacteria para poder asegurarnos de cuál es el verdadero causante de la lesión o de la enfermedad. En esto se basan los postulados de Koch que podéis ver en que consisten más abajo en el post. Sin embargo, hay bacterias que no se pueden crecer en laboratorio como la que causa la lepra. Otras necesitan vivir en consorcio con otras bacterias para poder crecer.  Los recientes estudios de microbioma, empleando las técnicas de secuenciación masiva, muestran que hay bacterias, como Fusobacterium nucleatum, que son coadyuvantes en la aparición de las metástasis en las células cancerígenas.

Aprendiendo a ser malas

La microbiología ha tenido que dar un salto conceptual en los años 80 del siglo pasado cuando los investigadores se dieron cuenta que había bacterias que eran comensales y no patogénicas y de repente se volvían patógenos. Lo que había ocurrido en ese caso es que la bacteria comensal había sido colonizada por algún transposón, plásmido... es decir, por un elemento genético móvil, normalmente de origen vírico, y esta bacteria pasaba de ser comensal a patógena. Esto es lo que le ha ocurido a Escherichia coli. Otro reto a la que se enfrenta la microbiología es a la aparición de bacterias resistentes a los antibióticos, y no solo eso, a la diseminación de los genes que les confieren resistencia a los antibióticos en elementos genéticos móviles como plásmidos, transposones, fagos...  De esta manera bacterias ambientales que eran inocuas en el pasado se han convertido en auténticas pesadillas sobre todo en el ámbito hospitalario. Por ese motivo, de rutina, se estudian la sensibilidad a los microbianos en los laboratorios de microbiología.

Los postulados de Koch: la lógica al servicio de la microbiología

Es protocolo para discernir entre las muchas bacterias o agente biológicos presentes en cualquier tejido de cualquier animal. Mientras que muchas bacterias aparecen como "parásitos" de lesiones provocadas por otros agentes, solo hay un agente que provoque realmente la lesión. La importancia de los postulados de Koch consiste en la utilización de cultivos puros, cosa que es necesaria para discernir el verdadero causante de la enfermedad.

1- El agente debe estar presente en cada caso de la enfermedad y ausente en los sanos.

2- El agente no debe aparecer en otras enfermedades.

3- El agente ha de ser aislado en un cultivo puro a partir de las lesiones de la enfermedad.

4- El agente ha de provocar la enfermedad en un animal susceptible de ser inoculado.

5- El agente ha de ser aislado de nuevo en las lesiones de los animales en experimentación.

Aunque la mayoría de las bacterias infecciosas causantes de enfermedad en humanos cumplen los postulados, hay algunas excepciones. Mycobacterium leprae, causante de la lepra, no se ha podido cultivar in vitro como cultivo puro, por lo que incumple el tercer postulado. Solo se ha podido cultivar in vivo en las almohadillas de las patas de un armadillo

En los años 80 del siglo pasado se introdujo el concepto de postulados moleculares de Koch. Estos nuevos postulados sirven para probar que el fenotipo de virulencia de algunas bacterias está asociado a un gen o un grupo de genes (normalmente de origen vírico) específico. Son los siguientes: 

1. Identificar un gen o producto génico que es responsable de la virulencia

2. El gen debe estar presente en el microorganismo que causa la enfermedad

3. El gen no debe estar presente en cepas avirulentas

4. Introducir el gen en una cepa avirulenta, le devuelve la virulencia

5. El gen se expresa in vivo durante la infección

6. La inmunidad específica contra el producto génico protege de la enfermedad

El caso de la bacteria que estaba donde no se esperaba que estuviese

J. Robin Warren y Barry J. Marshall, fueron premiados con el Nobel de Fisiología o Medicina de 2005 por descubrir que la bacteria Helicobacter pylori, y no el estrés, causaba las molestas úlceras de estómago. Su hallazgo tuvo unas consecuencias clínicas muy importantes. Desde que Marshall y su compañero J. Robin Warren publicaron sus investigaciones en la década de los ochenta, los pacientes aquejados de una úlcera de estómago comenzaron a ser tratados con antibióticos, que curaban estos problemas digestivos. Pero lograr aquel descubrimiento, luego premiado con el Nobel, no fue una tarea sencilla.

Según explica Marshall a Hipertextual, su intención era realizar "experimentos con humanos en algún momento" para comprobar su hipótesis. La comunidad médica había rechazado de forma mayoritaria sus ideas, ya que señalaban que las úlceras aparecían primero en el estómago y luego los microorganismos eran capaces de colonizar la zona afectada. El científico australiano defendía una hipótesis muy controvertida, según la cual Helicobacter pylori era un patógeno, no un simple comensal, que causaba los trastornos estomacales.

"Habíamos intentado inocular animales, como conejillos de indias e incluso cerdos, sin éxito. Son experimentos muy complejos, especialmente en el caso de los cerdos, porque se trata de animales muy grandes", cuenta a Hipertextual. Más tarde se dieron cuenta de que existen muy pocas especies que puedan ser infectadas con Helicobacter pylori por las proteínas que presenta.

El Nobel de Medicina de 2005 describe aquella época como "difícil", ya que la mayoría de sus artículos científicos eran rechazados o retrasados sin ninguna explicación. Movido por la frustración profesional, pero sobre todo convencido de que tenía razón, Barry Marshall decidió experimentar con la única persona dispuesta a firmar un consentimiento informado para realizar el estudio: él mismo. Así fue como acabó bebiendo una solución de bacterias en cultivo.

"Quería hacer un experimento en humanos y no podía hacerlo con el Dr. Warren porque ya había padecido la infección de Helicobacter. Yo no la había tenido nunca, así que me hice una endoscopia y todo resultó normal. Mi jefe incluso me hizo la prueba y me comentó 'que no estaba seguro de por qué me estaba realizando la endoscopia', pero me pidió que no se lo contara", dice Marshall durante la entrevista.

Unos días después de la realización de la endoscopia, el científico se bebió las bacterias en cultivo que había extraído de un paciente anteriormente aquejado de la infección y que había sido curado. "Así me aseguré de que el microorganismo era sensible a los antibióticos, por lo que si desarrollaba la úlcera me iba a poder curar", afirma.

Decidido a confirmar sus hipótesis, por arriesgados que fueran los experimentos —Helicobacter pylori aumenta el riesgo de padecer cáncer de estómago—, Marshall incluso evitó comentarle lo sucedido a su esposa. "Era una de esas ocasiones en las que era mejor pedir perdón que permiso", escribió el científico cuando recibió el premio Nobel.

Una semana después de beber la solución de bacterias, el investigador empezó a sufrir vómitos y a padecer una gastritis muy grave. Al realizarle una nueva biopsia, sus compañeros se dieron cuenta de que Helicobacter pylori había colonizado por completo el estómago de Marshall. Así fue como el joven médico desterró al estrés como la causa de las úlceras. En realidad era una bacteria capaz de vivir en un ambiente tan extremo como el entorno ácido del estómago la que las producía. Marshall había encontrado por fin la causa de las úlceras y, lo más importante, conseguía demostrar que eran curables con antibióticos, al igual que sucede con otras infecciones bacterianas.

Detección de bacterias: aislarlas allí donde se concentran

Las pruebas de laboratorio se suelen hacer a partir de muestras de urocultivos, hemocultivos, coprocultivos, cultivos de muestras respiratorias, biopsias a partir de heridas y cultivo o detección de antígenos del líquido cefalorraquideo (LCR). Se obtienen de estos sitios porque o bien las aislamos del foco en donde están generando problemas, como es el caso de las biopsias de heridas, o bien de los conductos en donde circulan fluídos en el cuerpo humano: urea, sangre, heces, aire o LCR. 

Conceptos bien importante en el aislado de las bacterias es evitar la contaminación cruzada con otras bacterias y el transporte de la muestra desde el sitio de recogida hasta el laboratorio para evitar que crezcan bacterias que contaminen la muestra y hagan la lectura del agente causante de la enfermedad complicada.

Para tomar una muestra debemos tener en cuenta lo siguiente:

• Seleccionar adecuadamente el sitio anatómico de donde se obtendrá la muestra.

• Tomar la muestra utilizando la técnica adecuada.

• Colocar la muestra en un recipiente adecuado.

• Transportar la muestra al laboratorio lo más rápido posible.

• De ser necesario, almacenar los especímenes adecuadamente.

Urocultivos

En un urocultivo se considera una bacteriuria como "significativa" o lo que es lo mismo una infección urinaria si se recuentan más de 100.000 UFC/ml de orina. Es lo que se conoce como criterio de Kass.

Clean Catch Urine of Specimen Collection Series with Dr. Michael Miller

I 701 Collecting a Midstream Urine Sample

¿Sabes como se realiza el procedimiento de urocultivo y orina completa?. Fuente: El ciudadano TV

Coprocultivos

Identificación de patógenos causantes de gastroenteritis

How to collect a fecal specimen: for patients. Fuente  Alpha-Tec Systems

El medio de transporte es el medio Cary Blair. Este medio mantiene el pH óptimo y un bajo potencial de oxido-reducción. Como carece de nutrientes la muestra no sufre modificaciones en el número de bacterias.

En los coprocultivos es clave la utilización de medios selectivos. Las heces tienen un contenido tan elevado de bacterias que poder discriminar las patógenas de las comensales es clave

Fuente: Microbiología e inmunología. TextbookKafir4. Ed. Marbán

Luego, con un simple test bioquímico podemos diferencias entre los distintos enteropatógenos utilizando el agar Kliger

Interpretación medio Kliger

Cultivos de heridas

                                            

WCW: Wound Biopsy. Fuente: WebCME

I705 Collecting a specimen for wound culture. Fuente: Skills lab

Clinical Connections- Wound Culture Techniques. Fuente: WebCME

La técnica Levine, como pudimos ver en el video, es mejor para la recolección de la bacteria causante de la infección.

Procedimiento para realizar cultivos cuantitativos con hisopos (método de Levine)

• Limpiar la herida con solución salina normal.

• Quitar /limpiar de tejido no viable.

• Esperar de dos a cinco minutos.

• Si la úlcera está seca, humedezca el hisopo con solución salina normal estéril.

• Cultive el tejido de aspecto más saludable de la herida.

• No cultivar exudado, pus, escaras o tejido muy fibroso.

• Gire el extremo de un aplicador con punta de alginato estéril sobre un área de 1 cm2 durante 5 segundos.

• Aplique suficiente presión al hisopo para hacer que se extraiga el líquido tisular.

• Utilice una técnica estéril para romper la punta del hisopo en un dispositivo de recolección diseñado para cultivo cuantitativo

Cultivo de sangre

Phlebotomy Procedure: Venipuncture with 21G Butterfly. Fuente: Crystastic Jewels

Blood Culture Collection Steps | Blood Collection (Rx-TN). Fuente: Sunsoars

Toma de muestra para Hemocultivo-Universidad Santo Tomas. Fuente: Flavio Salazar

Cultivo de muestras respiratorias

Identificación de patógenos causantes de neumonía, faringitis y otras infeeciones respiratorias

Cultivo de líquido cefalorraquídeo (LCR) y detección de antígeno capsular en LCR

Diagnóstico de microorganismos causantes de meningitis purulentas (meningitis bacteriana) y fúngicas (Criptococcus neoformans). Las muestras pueden ser sometidas a concentración bacteriana si existen niveles bajos de bacterias o virus, o amplificar mediante la detección de antígeno capsular.

PREGUNTAS: 

PREGUNTA 1: Se toma una muestra de coprocultivo. Carecemos del medio de transporte Cary Blair, se utiliza como sustituto un medio generalista. ¿Cómo puede esto afectar al posterior análisis?

a) No afecta en absoluto. Los medios de transporte son exclusivamente para transportar bacterias

b) No afecta en absoluto porque aunque pueda que crezcan las bacterias lo harán todas por igual y los ratios entre bacterias no se verán afectados

c) Afecta ya que en un coprocultivo existen bacterias que tienen distintos ratios de crecimiento y eso puede afectar al análisis ya que al aportar nutrientes las bacterias crecerían.

d) Las bacterias si no se transportan en un medio Cary Blair corren el riesgo de morir y eso afectaría al posterior análisis en el laboratorio

e) El medio generalista al no ser específico hace que crezcan las bacterias y puedan intercambiar plásmidos y ADN extracromosómico provocando la aparición de cepas nuevas y esto indudablemente alteraría el análisis subsiguiente

Resultado: c) Afecta ya que en un coprocultivo existen bacterias que tienen distintos ratios de crecimiento y eso puede afectar al análisis ya que al aportar nutrientes las bacterias crecerían.

Para saber más

García-LechuzMoya JM, González López JJ, Orta Mira N, Sánchez Romero MI. Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el Laboratorio de Microbiología. 2017. 1b. Sánchez Romero MI (coordinadora). Procedimientos en Microbiología Clínica. Cercenado Mansilla E, Cantón Moreno R (editores). Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). 2017.

Método Levine. • National Pressure Ulcer Advisory Panel, European Pressure Ulcer Advisory Panel and Pan Pacific Pressure Injury Alliance. Prevention and Treatment of PressureUlcers: Clinical PracticeGuideline. Emily Haesler (Ed.). Cambridge Media: Osborne Park, Western Australia; 2014. Página 185.

Zurita, Jeannete. Recolección y Transporte de Muestras en Microbiología Clínica. Organización Panamericana de la Salud Primera Edición 2004.