Diferenciar las eubacterias en dos bloques: tinción de Gram

Clave dicotómica: aprender a discriminar

El juego de las 20 preguntas consiste en pensar que algo concreto, una cosa, persona, animal... que todo el mundo que esté jugando conozca. Las personas que jueguen tienen que adivinar qué es en menos de 20 preguntas. Las preguntas tienen que estar formuladas de manera que se pueda contestar si o no. Este juego procede del juego "Twenty questions" que se juega en los EEUU desde el SXIX. 

En mis clases solía jugar este juego para explicar en qué consiste la clasificación dicotómica

Una clave dicotómica se basa preguntas sobre la presencia o no de caracteres morfológicos, de estructura, composición química... De esta pregunta parten dos soluciones posibles, en función de si tienen o no tienen determinado carácter. Las mejores preguntas son las que dividen el grupo en dos subgrupos más o menos 50% y 50%. De esa manera, a base de repetir el proceso de preguntas que dividen al grupo en subgrupos 50% y 50% podemos llegar a definir cualquier organismo vivo.

Tinción de Gram: distingue a los dos grandes grupos de bacterias

La Tinción de Gram consiste en una técnica de laboratorio diseñada por Christian Gram el año 1884. El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar diferentes grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas.

Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se tiñen de una forma u otra, lo que permite diferenciar las bacterias en dos bloques: Bacterias Gram positivas y las Gram negativas, de gran utilidad para elegir un determinado tratamiento antibiótico.

Así, las bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se denominan Gram negativas. Están formadas por una pared más fina formada por menos capas de peptidoglicano y una segunda membrana rica en lípidos (que repele la tinción Gram), al microscopio aparecen incoloras. La belleza de está técnica radica en que las eubacterias se dividen en Gram positivas y Gram negativas, es decir, lo que discrimina esta técnica de tinción son los dos grandes grupos en los que se dividen las eubacterias. 

Las Gram positivas suelen ser cocos, es decir, bacterias esféricas debido a su mayor turgencia (presión interna) y las Gram negativas bacilos, es decir, con forma de bastones

¿Cómo teñir?

El cristal violeta se une a la pared bacteriana y se estabiliza con el lugol. La mezcla alcohol-acetona disuelve la membrana externa de las bacterias Gram negativas (más fina que la de las Gram positivas) extrayéndose el cristal violeta. Después se tiñen solo las Gram negativas con safranina.

Pasos para realizar la tinción Gram

1 Tomamos bacterias con el asa y las diluímos en una gota de agua sobre el portaobjetos. Dejamos secar

2 Gota de violeta cristal durante 1 min.

3 Lavamos con agua

4 Gota de lugol (yodo) durante 1 min.

5 Lavamos con agua

6 Lavamos con alcohol 5-10 seg.

7 Lavamos con agua

8 Gota de safranina durante 1 min.

9 Lavamos con agua y secamos. Ponemos un cubreobjetos y al microscopio.

La pared celular, clave en la tinción de Gram

Las eubacterias como las Gram positivas y negativas son bacterias que tienen una alta concentración de sales en su interior y por ese motivo tienen una elevada presión osmótica. Aproximadamente las Gram positivas tienen 25 atm de presión interna y las Gram negativas entre 1 y 5 atm. Para evitar que esta presión haga explotar su membrana plasmática, ésta está rodeada de una capa de peptidoglicano.

Como se observa en la figura la capa de peptidoglicano en las Gram positivas es cinco veces más grande que en las Gram negativas ¿Puede ser porqué las Gram positivas tienen 5 veces más presión interna? ¡Por supuesto!

La estructura de la pared celular se compone de azúcares (NAG también llamada N acetil glucosamina y NAM o N acetil murámico) y de un puente entre las mureínas de aminoácidos unidos por enlace peptídico.

Azúcares y aminoácidos se tiñen fenomenal con el violeta cristal. 

El violeta cristal o también llamado violeta de metilo 10B es conocido como violeta de genciana y es el ingrediente activo en la Tinción de Gram. Es un colorante soluble en agua y etanol. Por eso tiñe azúcares y los aminoácidos de la pared celular y tiñe mal las grasas

La pared celular tiene que estar entrelazada para que sea una malla efectiva e impida que la célula explote debido a su turgencia o presión interna. 

La penicilina impide que la pared celular forme una malla y eso provoca que la célula literalmente explote. 

Preguntas: 

PREGUNTA 1: El distinto comportamiento  en la tinción de Gram ¿A qué crees que es debido? (pueden ser una o varias respuestas)

a) a las diferentes capas superficiales o paredes  de las bacterias que tienen los distintos tipos de célula.

b) A la cantidad de fosfolipidos  que tienen la gram negativas es mayor que las gram positivas.

c) A los peptidoglicanos, que es mayor en las gram positivas que en las gram negativas.

d) A las distintas formas que tienen las bacterias

e) A los distintos comportamientos mótiles, no mótiles, ameboides de las bacterias

Resultados: a, b y c

PREGUNTA 2: ¿Qué ocurre cuando usamos el objetivo de 100X y no usamos aceite de inmersión?

a) se reduce significativamente la dispersión de la luz

b) se incrementa la resolución de la imagen

c) Se reduce la resolución de la imagen

d) se forma una película viscosa entre el objetivo y el cubreobjeto

e) Puede rayarse el objetivo con el cubreobjeto

Solución: c) Se reduce la resolución de la imagen

Recursos:

https://learn.chm.msu.edu/vibl/content/gramstain.html

https://virtuallab.tlc.ontariotechu.ca/intro.php

Laboratorio virtual – AMRITA

No corre en Chrome, hay que descargar el navegador Firefox y descargar Adobe Flash Player.

Tiene simulaciones de casi todo, pero no es interactivo

Lab virtual de micro 1: https://vlab.amrita.edu/index.php?sub=3&brch=73

Lab virtual de micro 2: https://vlab.amrita.edu/index.php?sub=3&brch=76