Secuenciación por Síntesis (Illumina) para vigilancia de COVID

En un escenario de pandemia vírica como en la que estamos inmersos, tener una idea clara de las cepas del virus que están circulando es fundamental. Para ello, tenemos que secuenciar el mayor número de cepas para que tener una imagen lo más clara posible de cuál es la situación. Eso significa dinero y un reto tecnológico. 

Si no conseguimos vacunar a todo el mundo, o al menos un porcentaje alto de la población para que el virus no continúe transmitiéndose, vamos a tener cepas mutantes. No todas las cepas mutantes van a tener éxito en al población. Aquellas que tengan éxito serán variantes de preocupación. Debemos saber en qué países se encuentran y si las vacunas de las que disponemos son activas frente a estas nuevas variantes. 

Cuando secuencié mi primer gen, que publicamos en 1996, la tecnología era bastante primitiva. Hoy en día, aquello con lo que peleábamos en los laboratorios de investigación está pulido y afinado por algunas empresas que han conseguido estandarizar, optimizar y abaratar el proceso.

El primer paso que tenemos que hacer para secuenciar un virus como Sars-CoV-2 es retrotranscribir su ARN en ADN. El ADN es una molécula más estable y más fácil de operar. 

 En el diagrama abajo se puede apreciar todos los pasos que tenemos que seguir para llegar a tener el genoma de las cepas de Sars-CoV-2 que vamos a secuenciar.

Hay mucha bioquímica y biología molecular en todo el proceso. Intentaré resumirlo. Los trucos que utilizan, en este caso los científicos e ingenieros, se basan en tener millones de copias de cada uno de los fragmentos que vamos a secuenciar, tener los fragmentos identificados con secuencias características de ADN característicos, la capacidad de unir el ADN a perlas magnéticas que nos permiten limpiar el ADN y seleccionar fragmentos de una longitud determinada. Al tener muchísimas copias de cada fragmento, cuando se secuencien, usando la técnica de nucleóticos que al unirse al fragmento que se están copiando y emiten luz, podemos descartar aquellas emisiones de luz que son poco claras ¿Por qué? por que tenemos millones de lecturas y podemos darnos el lujo de eliminar aquellas que no tengan un nivel de calidad aceptable.

¿Cómo conseguimos que la muestra de un pocillo de una placa de 96 esté correctamente identificada?

Gracias a los UDI (Unique dual indexes) podemos tener secuencias de índice distintas y no relacionadas para cada una de las lecturas de índice i5 e i7 en cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos.

Fuente

Se trata de una placa de 96 pocillos en los que los UDIs ya están precargados, así que cuando pones la muestra y esos fragmentos se incorporan a las secuencias que quieres secuenciar, los UDIs se incorporan a los fragmentos identificándolos a cada uno de los pocillos. De esa manera podemos tener las 96 muestras (incluidos los controles positivos y negativos) identificadas correctamente ¿Cuál es la ventaja? que podemos ahora meter las 96 muestras en un solo tuvo ¿Qué significa eso? que no tenemos que pipetear en los 96 pocillos, ahora trabajamos ¡Con un solo tubo! quien sabe lo que eso significa le hace la ola a los que diseñaron este método.

Perlas magnéticas limpian y estandarizan la longitud de nuestros fragmentos

Secuenciación por Síntesis (Illumina): Conceptos Básicos. Fuente

Secuenciación de amplicones CleanPlex para ADN y ARN-Seq

Tecnología de secuenciación de amplicones CleanPlex para ADN y ARN-Seq

https://www.paragongenomics.com/targeted-sequencing/amplicon-sequencing/cleanplex-ngs-amplicon-sequencing/

Criterios para decidir que muestras a analizar:

No deben de ser familiares, el Ct debe ser menor de 28. Tienen que ser mayores de edad. Debemos saber cual es su domicilio

El valor Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ARN en la muestra. Por tanto, un valor alto significa que hacen más ciclos de amplificación de la PCR para poder tener una cantidad apreciable de ARN amplificado. Fuente

RNA quantification (Qbit4). Debemos partir de un mínimo de 5 ngr

Al laboratorio nos llegan las placas de 96 pocillos con el ARN de los pacientes. Hay que descongelarlas. Este ARN es el que se utiliza en los laboratorios clínicos para las RTPCRs de las personas a las que se quiere saber si son positivas para Sars-CoV-2. No se secuencian todas las muestras

Aquí las placas vienen con un punto que corresponde a las muestras que nos interesan: provenientes de mayores de edad, de los cuáles sabemos donde viven, que su ct sea <28. Esto se hace para tener muestras lo más distintas posibles entre si para que nos muestren una "radiografía" los más precisa de la composición clonal del Sars-CoV-2 en el Ecuador. Una vez tomamos la muestra las volvemos a congelar. Los volúmes de muestra que tomamos van a depender de la concentración de muestra que tengamos. Para ello, debemos debemos cuantificar por duplicado en el Qubit4. Una vez sabemos cuál es la concentración de nuestras muestras las diluimos para que la concentración de ARN sea un valor entre 50 y 60 ngr de ARN. 

Para cada secuenciación tomamos 24 muestras que es lo que soporta el secuenciador.

1A RT-Reaction (90 min)

Ahora tenemos agua, muestra y primers. Homogenizamos con un shaker 5 seg a 1600 rpm

Le damos un spin para bajar la muestra y la metemos en la máquina de RT-PCR con el siguiente programa: 

Cuando hagamos el mix debemos recordar que tenemos que x25 porqué tenemos 24 muestras

Las pipetas las debemos de limpiar de RNasas con: 

1B Post-RT-purification

2A Multiplex PCR reaction

2B Post-mPCR purification

3A Digestion reaction

3B Post Digestion purification

4A Second PCR reaction

4B Post-second PCR purification

Store at -20°C

Monocercomonoides: la célula eucariota sin mitocondrias

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Protocolo de diagnóstico de COVID mediante ELISA

Antígeno recombinante de la espícula S1 (RBD) para COVID-19 (SARSCoV-2). Fuente

Los coronavirus son virus envueltos que poseen glicoproteínas (S) de pico trimérico grandes requeridas para el reconocimiento de los receptores del huésped para muchos coronavirus, así como para la fusión de las membranas virales y de las células huésped para la entrada del virus en las células. Durante la salida viral de las células huésped infectadas, algunas proteínas del coronavirus S se dividen en subunidades S1 y S2. La subunidad S1 es responsable de la unión huésped-receptor, mientras que la subunidad S2 contiene la maquinaria de fusión de membranas. Por tanto, la subunidad S1 contiene el dominio de unión al receptor (RBD), ubicado en la región C-terminal. Este dominio se utiliza como biomarcador para el diagnóstico de COVID.

Protocolo de ELISA indirecto IgG anti-SARS-CoV-2

1. Sensibilizar (día anterior) una placa Inmunolon de 96 pocillos con 50ul/pocillo de 2.5 µg/ml de proteína recombinante (antígeno) RBD en buffer fosfato salina (PBS1X) - ponemos 4987,5 µl de PBS 
1X y 12,5 µl de RBD, durante toda la noche a temperatura ambiente en cama húmeda.

PREPARACIÓN BÚFERES
Buffer de Lavado: Preparar 1 litro. 900 ml de agua destilada estéril + 100 ml de PBS 10X + 1 ml tween.
Preparar 200 ml de PBS 1X: 180 ml de agua destilada estéril + 20 ml de PBS 10X
Buffer de Bloqueo: 12 ml PBS 1X + 0.48 g BSA + 12 µl Tween.
Buffer de dilución: 100 ml PBS 1X + 100 µl Tween + 5 g leche

PROGRAMA DE LAVADOS

Hacer un lavado con 60 µl antes de iniciar el proceso.

Luego de cada lavado realizar lavados con 10 µl.

El terminar, hacer dos lavados con 60 µl. y posteriormente con agua destilada estéril y luego en seco.

Video ELISA para detección de Sars-Cov2 (Covid 19). 

2. Desechar la solución de antígeno no fijada y lavar la placa UNA vez con 270 µl por pocillo con            PBS-T (Programa 1 Lavador de ELISAS).

3. Bloquear la placa con 100 µl/pocillo con Buffer de bloqueo, durante 30 minutos a 37°C. 

4. Desechar la solución de bloqueo y lavar la placa 5 veces con 270 µl por pocillo de PBS-T                        (Programa 2 Lavador de ELISAS).

5. En un tubo eppendorf colocar 495 µl de buffer de dilución y 5 µl de muestra (incluir control                     negativo, positivo y pool´s), homogenizar por 2 minutos.

6. Añadir 100 µl de cada tubo eppendorf (respectivamente) en la placa.

7. Incubar a 37°C durante 1 hora (Si se pasa un poco el tiempo, no importa… mucho, pero EVITAR         que se quede seca la placa).

8. Lavar las placas 5 veces con 270 µl por pocillo de PBS-T (Programa 3 Lavador de ELISAS).

PREPARACIÓN DE BUFER

Buffer de conjugado: Colocar 10000 µl de buffer de dilución y 1,25 µl de goat anti IgG humana-HRP

9. Adicionar 100 µl de conjugado por pocillo e incubar a 37°C durante 30minutos.

Min 8:22 Adición del anticuerpo conjugado

10. Lavar las placas 7 veces con 270 µl por pocillo de PBS-T (Programa 4 Lavador de ELISAS).

PREPARACIÓN Sustrato OPD

En 10 ml de agua ultrapura, disolver la MITAD de la pastilla DORADA y antes de utilizar el sustrato añadir la MITAD de la pastilla PLATEADA. PROTEGER DE LA LUZ.

Min 11:23 Preparación sustrato OPD para visualizar la fluorescencia

11. Añadir 100 µl por pocillo de Sustrato OPD preparado fresco.

12. Incubar 10 minutos en la oscuridad.

13. Detener la reacción con 100 µl por pocillo de ácido clorhídrico 3N.

14. Leer las placas en un lector de ELISA a 490 nm.

        1. Entrar al programa Gen 3.08

        2. Standard

        3. Placa 11

        4. Protocol

        5. Plate Layout (ordenar)

        6. Verificar a 490 nm

        7. Read new

        8. Cálculos de ELISA

Fagos generan genotipos mutantes ganadores en heridas colonizadas por Pseudomonas

 Tendemos a pensar que un virus solo puede causar desgracias. En un artículo reciente han demostrado en un modelo de herida, en el que varias cepas bacterianas compiten por colonizar ese espacio abierto, que las cepas ganadoras tienen varias mutaciones generadas por fagos lisogénicos.

Ciclo lítico y lisogénico de los fagos. Fuente

Los fagos interaccionan con las bacterias de dos maneras. La primera es la lítica, es decir, entro en ese saco rico en moléculas, que es lo que es una bacteria para un fago, hago copias de mi mismo y ciao a seguir replicándome por ahí. Básicamente a lo que se reduce el aspecto biológico de cada uno de nosotros. Los fagos lisogénicos pueden además insertar su ADN en el ADN de la bacteria. Al hacer esto pueden causar mutaciones. De esta manera se pueden generar nuevos genotipos mutantes que pudieran tener una mejor adaptación al ambiente. 

En los humanos, los nuevos genotipos mutantes los solemos conseguir en la siguiente generación mediante el sexo.

Timoni, Montagu, Jenner: el camino hacia la extinción del virus de la viruela

Emmanuel Timoni,  (1670-1718) fue médico al servicio de la embajada británica en Constantinopla a principios del siglo XVIII. Su nombre permanece unido a la propagación de la inoculación contra la viruela en Europa. Graduado de la Universidad de Padua, miembro de la Royal Society de Londres desde 1703, el doctor Timoni publicó en 1713 en las Philosophical Transactions of the Royal Society su tratado sobre la inoculación. Su trabajo fue publicado nuevamente al año siguiente en Leipzig. En este trabajo mencionó a mujeres otomanas que, para protegerse de la viruela, adquirieron el hábito de contagiarse levemente pinchándose con una aguja empapada en pus.

Fue Timoni el que convenció a Mary Wortley Montagu que difundiese las virtudes de la inoculación en Inglaterra. Posteriormente, Edward Jenner, gracias a su elegante experimento con el niño James Phillips

en 1796, demostró científicamente que la vacuna era segura y que realmente protegía de la viruela. De esta manera, las vacunas empezaron a ser la mejor y más barata herramienta con la que cuenta la medicina para salvar vidas. 

Edward Jenner publicó sus resultados en 1800. En 1803 sale de A Coruña la Real Expedición Filantrópica de la Vacuna con destino a América para vacunar al máximo número de personas contra la viruela. Esta se convirtió en la operación de salud pública más importante de la historia. La expedición arribó a Quito de la mano de Saldaña y fue acogida con entusiasmo por la población, por lo que Quito puede presumir en ser una de las primeras ciudades en realizar una campaña de vacunación masiva del Mundo. 

Expedición Balmís o de la Real Expedición Filantrópica de la Vacuna

La historia de la vacuna ejemplifica como funciona el método científico. Primero, las mujeres, que atentas a aquello que pudiese proteger la vida de sus hijos, se dieron cuenta que inocularse el pus de personas enfermas no enfermaban y quedaban protegidas de contagiarse del virus. Ellas no sabían porqué pasaba, pero ello no las frenó de hacerlo ya que sabían que aquellas que lo hacían quedaban protegidas. Lo que hizo Jenner fue el típico experimento que permitió, de una manera lógica, afirmar que efectivamente, esa práctica nos protegía del virus y hacía que no desarrollásemos la enfermedad. A partir de ahí, lo único que había que hacer era llevar la vacuna a todo el mundo hasta que el virus, al no tener personas no vacunadas que infectar se extinguiese. 

Ese día llegó. El día 9 de diciembre de 1979 se declaró oficialmente extinguido el virus de la viruela humana.