Cómo detectar Porphyromonas gingivalis

La Diversidad de cepas en Porphyromonas gingivalis han demostrado que las cepas de P. gingivalis varían en su virulencia (destrucción y muerte de tejidos blandos) en modelos animales, y algunas cepas se clasifican como virulentas, por ejemplo, las cepas W83, W50, ATCC 49417 y A7A1, y otras se clasifican como avirulento, por ejemplo, cepas 381, 33277 y 23A4

Virulentas

ATCC 49417 9 publicaciones
ATCC A7A1 6 publicaciones
ATCC W83 73 publicaciones
ATCC W50 45 publicaciones. Cepa "wild type"

Avirulentas

ATCC 33277 342 publicaciones. Se usa como cepa tipo. En esta publicación se analizó el diferente perfil genético en biofilms versus células plantónicas.

ATCC 381 119 publicaciones

Colonias de P. gingivalis cultivadas en agar sangre. El hemo del medio es oxidado por las bacterias para producir hemina que se acumula en la superficie celular produciendo un pigmento negro característico después de aproximadamente 7 días de incubación anaeróbica. Fuente

Gen HmuY de Porphyromonas gingivalis 

ATCC 33277, NCBI Reference Sequence: NC_010729.1

>NC_010729.1:c610707-610057 Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, complete sequence

ATGAAAAAAATCATTTTCTCCGCACTCTGTGCATTGCCATTGATTGTGTCTCTAACTTCTTGTGGGAAGAAGAAAGACGAGCCGAACCAACCCTCCACACCCGAAGCAGTAACCAAAACCGTAACTATCGATGCTTCGAAATACGAAACGTGGCAGTATTTCTCTTTTTCCAAAGGTGAAGTCGTAAATGTTACCGACTATAAGAACGATTTGAACTGGGACATGGCTCTTCACCGCTATGACGTTCGTCTCAATTGTGGCGAAAGTGGCAAGGGAAAAGGTGGTGCCGTATTCTCCGGCAAGACAGAAATGGATCAGGCTACTTCCGTTCCGACAGACGGATATACCGTAGATGTTCTCGGCCGTATTACAGTCAAGTACGAAATGGGACCTGATGGTCATCAGATGGAATATGAAGAACAGGGCTTCAGCGAAGTGATTACCGGCAAGAAGAACGCACAGGGATTTGCTTCAGGTGGTTGGCTGGAATTCTCTCACGGTCCTGCCGGTCCCACTTACAAGCTGAGCAAAAGAGTCTTCTTCGTTCGTGGTGCTGATGGTAATATTGCCAAAGTGCAGTTCACTGACTATCAGGATGCAGAACTCAAAAAAGGAGTCATCACTTTCACTTATACATACCCCGTTAAATAA

El gen HmuY es una proteína de unión al hierro que es característica de Porphyromonas gingivalis. Por ese motivo, ha sido seleccionada para detectar mediante PCR esta bacteria.

Diagrama de la amplificación isotérmica LAMP. Fuente

Para diseñar primers para una amplificación isoterma usando LAMP la página de NEB.primers nos da el siguiente resultado:

F3_P7 TCCGACAGACGGATATACCG
B3_P7 ACCACGAACGAAGAAGACTC
FIP_P7 TCGCTGAAGCCCTGTTCTTCATTCTCGGCCGTATTACAGTCA
BIP_P7 ACGCACAGGGATTTGCTTCAGGGCTTGTAAGTGGGACCGG

Dado que P. gingivalis es una bacteria anaerobia, podría ser interesante ampliar un fragmento que contenga el gen para utilizarlo como template en las amplificaciones de LAMP

Para ello, escogemos un fragmento del genoma completo de P. gingivalis ATCC 33277 que es la bacteria que tenemos en nuestro laboratorio, ese fragmento va desde la posición 610000 a la 610757

>NC_010729.1:610000-610757 Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, complete sequence

AAAGCAGGCCGATGAGGGCCTGCTTTGTTACTACACTTTTCATATTTCCCTCTTAACTTATTTAACGGGGTATGTATAAGTGAAAGTGATGACTCCTTTTTTGAGTTCTGCATCCTGATAGTCAGTGAACTGCACTTTGGCAATATTACCATCAGCACCACGAACGAAGAAGACTCTTTTGCTCAGCTTGTAAGTGGGACCGGCAGGACCGTGAGAGAATTCCAGCCAACCACCTGAAGCAAATCCCTGTGCGTTCTTCTTGCCGGTAATCACTTCGCTGAAGCCCTGTTCTTCATATTCCATCTGATGACCATCAGGTCCCATTTCGTACTTGACTGTAATACGGCCGAGAACATCTACGGTATATCCGTCTGTCGGAACGGAAGTAGCCTGATCCATTTCTGTCTTGCCGGAGAATACGGCACCACCTTTTCCCTTGCCACTTTCGCCACAATTGAGACGAACGTCATAGCGGTGAAGAGCCATGTCCCAGTTCAAATCGTTCTTATAGTCGGTAACATTTACGACTTCACCTTTGGAAAAAGAGAAATACTGCCACGTTTCGTATTTCGAAGCATCGATAGTTACGGTTTTGGTTACTGCTTCGGGTGTGGAGGGTTGGTTCGGCTCGTCTTTCTTCTTCCCACAAGAAGTTAGAGACACAATCAATGGCAATGCACAGAGTGCGGAGAAAATGATTTTTTTCATAATTATCTGACCTTACTTTTAATAGGTTTCATCCGGCTGCAAAGTTGAGA

Primer forward: 5´GGGCCTGCTTTGTTACTACAC 3´
Primer reverse: 5´TGCAGCCGGATGAAACCTATT 3´

Tomar muestras de P. gingivalis con puntas de papel

En este artículo describen el procedimiento. 

Puntas de papel para toma de muestras. Fuente

Como sembrar y cultivar anaerobiamente. Fuente

Las colonias obtenidas se pueden identificar por Viteck–2 usando las tarjetas ANC. También se puede utilizar el Maldi-TOF.

Amplificar el gen mediante LAMP

La reacción LAMP para la detección de P. gingivalis se llevó a cabo usando una amplificación de ADN Loopamp kit (Eiken Chemical Co., Ltd., Tochigi, Japón) en 25 ul volumen. La mezcla de reacción contenía 40 pmol cada uno de FIP y BIP, 5 pmol de cada uno de los cebadores F3 y B3c,

2 ul de ADN de la bacteria, 1 ul de Bst ADN polimerasa y 12,5 ul de mezcla de reacción preparada en el kit. La mezcla de reacción se incubó a 60, 62, 64 o 66ºC durante 30 o 60 min. Después de la incubación, la reacción se terminó calentando la mezcla de reacción a 80ºC por 2 minutos

Detección a simple vista por SYBR Green

Para detección a simple vista, se añadió a la mezcla de reacción 1,0 ul de SYBR Green I diluido  10^-1 o 10^-3  (Takara Bio Inc., Otsu, Japón). El cambio de color se observa a simple vista. La inspección del tubo con SYBR Green I diluido 10^-3  se realizó bajo luz UV (longitud de onda de 302 nm). El cambio de color de las muestras con SYBR Green diluidas  10^-1 se ven bajo luz natural.

Inspección a simple vista de las reacciones positivas (Pg 20 y Pg200) y negativas (Pg -) de la amplificación LAMP. a) El color naranja original de SYBR green del control negativo se torna en verde en el control positivo. b) la fluorescencia de la unión al ADN al  SYBR green I se detectó visualmente bajo luz ultravioleta. La detección límite de ambas inspecciones a simple vista con SYBR green I fue inferior a 20 células (Pg20). c) La reacción LAMP también se inspeccionó a través de blanco

turbidez del tubo causada por el pirofosfato de magnesio, un subproducto de LAMP. El límite de detección de la turbidez blanca fue a 200 células (Pg200). Fuente

Reactivos

TempliPhi™ 100 Amplification Kit

Bst DNA/RNA Polymerase

WarmStart® LAMP Kit (DNA & RNA)

También necesitaríamos SBYR Green I