Amplificación LAMP de ARN de Sars-CoV-2

Fig. 1. LAMP es un tipo de PCR isoterma que utiliza 4 o 6 primers

Video 1: Loop mediated isothermal amplification (LAMP protocol explained)

WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix Typical LAMP Protocol (M1800)

Configuración de la reacción: Para simplicidad de la reacción, se recomienda realizar soluciones stock de los primers de LAMP a una concentración de utilidad. Por ejemplo, se sugiere preparar un Primer Mix de concentración 10X con todos los 6 primers de LAMP.

Un Primer Mix 10X de LAMP contiene:

Primer	10X Concentration (Stock)	1X Concentration (Final)
FIP	16 μM	1.6 μM
BIP	16 μM	1.6 μM
F3	2 μM	0.2 μM
B3	2 μM	0.2 μM
LOOP F	4 μM	0.4 μM
LOOP B	4 μM	0.4 μM

Nota: Preparar las soluciones stock en agua de Grado Biología Molecular, en vez de TE u otras soluciones tampón para evadir su interferencia en la reacción de LAMP. Preparar el stock de primers en agua libre de nucleasas y almacenar a –20°C.

1. Dejar descongelar los componentes a temperatura ambiente y colocar en hielo (o gradilla fría). Puede formarse sal en el fondo de los tubos; colocar en el vórtex brevemente o invertir el tubo varias veces para mezclar. Centrifugar para juntar y colocar en el hielo.

2. Preparar el mix de la reacción como se describe en la tabla inferior, usando el Colorimetric LAMP Master Mix, los primers de LAMP y el agua libre de nucleasas. Los volúmenes están definidos para 25 μL de reacción de LAMP, pero pueden utilizarse otros volúmenes (10, 20, 50 μL etc.), ajustar los volúmenes de acuerdo a su necesidad. Se asume que la muestra es de 1 μL, pero para volúmenes mayores de muestra ajustar los componentes y reducir el volumen de agua para compensar. Para reacciones sin muestra, añadir el volumen equivalente de agua.

	DNA Target	RNA Target	No-Template Control (NTC)
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix	12.5 μL	12.5 μL	12.5 μL
LAMP Primer Mix (10X)	2.5 μL	2.5 μL	2.5 μL
Target DNA	1 μL	-	-
Target RNA	-	1 μL	-
dH2O	9 μL	9 μL	10 μL
Total Volume	25 μL	25 μL	25 μL

3.    Colocar el mix en el vórtex y luego centrifugar.

4.    Tomar con una pipeta 24 μL del mix por reacción a realizar y colocarlos en cada tubo de reacción. Añadir 1 μL muestra al mix. Mezclar los componentes en el vórtex o pipeteando varias veces y centrifugar para juntar de ser necesario. Cerciorarse de que las soluciones de reacción tengan un color rosa brillante, lo cual indica que el pH inicial es el requerido para la reacción de LAMP.

5.    Tapar los tubos de reacción 

6.    Incubar a 65°C por 30 minutos.

7.   Retirar los tubos de la incubación y examinarlos a la vista. Las reacciones positivas se tornarán de color amarillo, mientras que las negativas permanecerán de color rosa. Si el cambio de color no es completo (Ej.: se visualiza un color anaranjado), devolver los tubos a la incubadora a 65°C por otros 10 minutos. Las reacciones pueden ser examinadas más temprano; reacciones de muestras concentradas o de controles positivos pueden exhibir el cambio de color a los 10-15 minutos. El color será visible en los tubos inmediatamente luego de retirarlos de la incubadora, pero puede ser intensificado si se los deja enfriar a temperatura ambiente.

8. El resultado colorimétrico puede ser fotografiado o escaneado para registro, o simplemente almacenado a temperatura ambiente en los tubos de reacción.

Fig. 2. El kit tiene un sistema colorimétrico que nos muestra cuando la amplificación ha sido positiva

Resultados de los alumnos: de izquierda a derecha negativo, negativo, positivo, negativo, intermedio (habría que dejarlo media hora más) y positivo