Práctica de clonación in silico de un gen

El hecho de que todos los seres vivos compartamos el mismo lenguaje genético nos permite hacer copia-corta-pega de unos genes e introducirlos de una especie a otra. Por ejemplo, podemos copiar por PCR un gen humano como puede ser la insulina e introducirlo en una bacteria para que ésta produzca la proteína humana. 

Esta técnica tiene 4 pasos básicos. Primero tenemos que tener un plásmido, que es una molécula de ADN circular que se puede introducir en una bacteria, y amplificamos por PCR el gen que queramos introducir en la bacteria. Segundo, digerimos ambos con una enzima de restricción de manera que tienen los dos los mismos extremos. Tercero, esos extremos se pueden volver a "pegar" gracias a una enzima llamada ligasa. Por último, lo que tenemos que hacer es introducir este plásmido con el gen en una bacteria. Es lo que se llama transformación. La bacteria ahora va a producir una proteína humana. 

Experimento explicado en video: Clonación de un gen in silico: gen gyrA

Para este ejercicio vamos a amplificar el gen gyrA de Streptococcus pneumoniae e introducirlo en el plásmido pUC19.

Entramos en NCBI y en la base de datos "nucleotide" buscamos: gyrA Streptococcus pneumoniae Fernandez-Moreira. La secuencia que obtenemos es un contig que contiene el ORF correspondiente al gen gyrA de Streptococcus pneumoniae.

Copiamos el fragmento de ADN en FASTA

Entramos en ORF-Finder y pegamos el documento FASTA. De esta manera encontramos el ORF correspondiente al gen gyrA de S. pneumoniae

Hacemos Blast y comprobamos que efectivamente se trata del gen gyrA

Copiamos el ORF1 que tiene una longitud de 2508 nt. A partir de ahora, el ORF1 correspondiente al gyrA estará resaltado en amarillo albero. 

Si introducimos este ORF1 en la página Neb Cutter podremos ver qué dianas de restricción tiene este ORF1 en su secuencia

Hacemos clic en submit y este es el resultado de las dianas de restricción que existen dentro de la secuencia del Orf de gyrA.

A la derecha de esta ventana se ve un recuadro gris. Es la lista de las enzimas que no tienen diana en esa secuencia (0 cutters). Las enzimas que están en esta lista son las que nos interesan. Nos interesa diseñar los primers con una diana para una enzima que no corte el interior del orf que queremos clonar. Por ejemplo, la enzima BamHI. Vamos a elegir esta última. Esta enzima no tiene diana en el interior del orf de gyrA.

Los plásmidos tienen una región llamada polylinker que concentra una única diana para distintas enzimas de restricción

Asimismo, buscamos un plásmido que tenga un solo sitio de corte para la enzima que vamos a utilizar para cortar tanto nuestro fragmento amplificado por PCR como nuestro plásmido pUC19

En este plásmido, pUC19, archivo FASTA pUC19, solo hay una diana para BamHI. Este plásmido tiene un polylinker, que es una región de su ADN que concentra muchas dianas de restricción. Polylinker de pUC19 (en mayúsculas, en rojo la diana de BamHI):

5´agtgGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTcgtaa

Digestión pUC19 con BamHI:

El plásmido pUC19 tiene 2686 nt. Con la secuencia FASTA comprobamos que solo tiene una diana para la enzima BamHI en la applicación NEB Cutter. 

5´tgGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTcg 3´

3´acCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCCGTACGTTCGAAgc 5´

5´tgGAATTCGAGCTCGGTACCCGGG     3´

3´acCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAG 5´

                       5´ GATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTcg 3´

                       3´     GAGATCTCAGCTGGACGTCCGTACGTTCGAAgc 5´ 

>lcl|ORF1 CDS

5´ATGTTGTTACTTACTAATTG…………AAACAGAAGGTGAAGCATAA 3´
3´TACAACAATGAATGATTAAC…………TTTGTCTTCCACTTCGTATT 5´

Los puntos suspensivos corresponden a la secuencia del ORF que va entre los extremos del principio y del final. Para lo que es el diseño de los primers no es necesario escribirla y por eso se sustituye con puntos suspensivos.

                       
5´ATGTTGTTACTTACTAATTG…………AAACAGAAGGTGAAGCATAA 3´
                        3´TTTGTCTTCCACTTCGTATT 5´
                               Primer EFM1
     Primer EFM2
5´ATGTTGTTACTTACTAATTG 3´
3´TACAACAATGAATGATTAAC…………TTTGTCTTCCACTTCGTATT 5´

Los primers EFM1 y EFM2 nos permitirían amplificar este gen. Pero queremos hacer algo más que amplificarlo. Queremos introducirlo en un plásmido para luego expresar ese gen en una bacteria. 

Para ello tenemos que amplificar este ORF con dianas para una enzima de restricción que no tenga una diana en la secuencia del ORF de gyrA y que esta enzima de restricción solo tenga una diana en el plásmido en donde queremos clonar el gen. Por ejemplo, la diana para la enzima BamHI:          
         5´GGATCC 3´      5´G        GATCC 3´

         3´CCTAGG 5´      3´CCTAG        G 5´

   

Diseñamos primers que incorporen la diana BamHI

Primer EFM1+BamHI: 5´ GCGCGGATCCTTATGCTTCACCTTCTGTTT 3´
Primer EFM2+BamHI: 5´ GCGCGGATCCATGTTGTTACTTACTAATTG 3´

A los primers, en sus extremos 5´se les añaden, además de las dianas para la enima BamHI, cuatro nucleóticos GCGC. El objeto de añadir al extremo de la cadena estos 4 nucleótidos es para que la diana GGATCC tenga la forma correcta para que la enzima se pueda unir y digerir correctamente. Si no estuviesen estos cuatro nucleótidos la cadena en sus extremos tiende a no estar enrrollada en una hélice tipo B, es decir, con 10.4 pares de bases por vuelta. Por ponerlo en palabras comunes, la cadena de ADN en su extremo está un poco "deshilachada". 

Al unirse los nuevos primers van a adicionar dianas de restricción en los extremos: 

                                  

5´          ATGTTGTTACTTACTAATTG…………AAACAGAAGGTGAAGCATAA           3´

3´                                  TTTGTCTTCCACTTCGTATTCCTAGGGCGC 5´

                                           Primer + BamHI EFM1

        Primer + BamHI EFM2

5´GCGCGGATCCATGTTGTTACTTACTAATTG 3´

3´          TACAACAATGAATGATTAAC…………TTTGTCTTCCACTTCGTATT 5´

Producto PCR con primers + diana para BamHI:

5´GCGCGGATCCATGTTGTTACTTACTAATTG…AAACAGAAGGTGAAGCATAAGGATCCGCGC 3´
3´CGCGCCTAGGTACAACAATGAATGATTAAC…TTTGTCTTCCACTTCGTATTCCTAGGCGCG 5´

Ahora este fragmento tiene 2508 nt + 10 nt extras por la izquierda y 10 nt extras por la derecha. En total 2528 nt

Producto digestión BamHI:

5´    GATCCATGTTGTTACTTACTAATTG…AAACAGAAGGTGAAGCATAAG     3´
3´        GTACAACAATGAATGATTAAC…TTTGTCTTCCACTTCGTATTCCTAG 5´

Ahora el fragmento digerido tiene 2518 nt

Ligación pUC19 + fragmento amplificado por PCR:

5´tgGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCATGTTGTTACTTACTAATTG…AAACAGAAGGTGAA
3´acCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGTACAACAATGAATGATTAAC…TTTGTCTTCCACTT

GCATAAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTcg 3´

CGTATTCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCCGTACGTTCGAAgc 5´

¿Cuántos nucleótidos Ligación pUC19 + fragmento amplificado por PCR?

El ORF1 que tiene una longitud de 2518 nt. El plásmido pUC19 tiene 2686 nt entonces el resultado la ligación tiene 5204 nt

Tu verdad está en el otro

Los primeros seres vivos, los ribozimas, competían entre ellos por dejar el mayor número de descendientes. Vivían confinados a los espacios intercapas de silicatos de las arcillas húmedas. Cuando el ribosoma es capaz de traducir su código a proteínas hubo un diálogo entre el código de proteínas y el código genético del ARN. Las proteínas son un código estructural y químicamente más rico que el del ARN. Se pueden encender, apagar, generar redes lógicas. Fue el momento de los protovirus. Virus ARN con cápside proteica. En este mundo empezaron a aparecer nuevas formas de guardar la información que aumentaba con el tiempo. Información valiosa. Ahí apareció el ADN. De esos protovirus pertenecientes al grupo I de la clasificación Baltimore de los virus venimos nosotros. Cuando aparecieron los primeros organismos con cubierta lipídica, las arqueobacterias, éstas se quedaron en el interior de su citoplasma con todos los nutrientes de la sopa biológica. Los protovirus comenzaron a entrar en las células para reproducirse en su interior, la antigua sopa biológica. En ese momento comenzó a ser importante las relaciones parasíticas. 

Los primeros virus gigantes fueron descritos en 2003 y al primero se le llamó mimivirus. Desde entonces se han descubierto los llamados pandoravirus y estudiado sus genomas. Se caracterizan por su tamaño, mayor a 200 nanómetros, cuando los virus comunes se definen por ser menores de 200. Los pandoravirus forman parte de la familia de virus gigantes y pueden ser hasta 10 veces más grandes que un virus común, llegando incluso a medir tanto o más que otras bacterias pequeñas. Además, poseen muchos más genes. El virus de la influenza A, por ejemplo, tiene un genoma formado por unos ocho genes. Un pandoravirus, como el salinus, puede albergar unos 2.500.

Investigando los virus gigantes se han descubierto cosas tan sorprendentes como que suelen ser objetivo de los virus caníbales, es decir, virus que parasitan otros virus. Los virófagos (taxón Lavidaviridae), llamados también virus caníbales, son virus que parasitan a otros virus y son virus satélite de ADN bicatenario. La diana de estos virus antivirus es siempre un virus gigante al que producen malformaciones en el momento de su replicación dentro de la célula hospedadora.

Grupo I: Virus ADN bicatenario (Virus ADNbc o Virus dsDNA). Los ejemplos de los virus de la clase I incluyen Herpesviridae, Adenoviridae, y Papoviridae. El ARNm se transcribe directamente a partir del genoma del virus, que es una doble cadena de ADN. Las proteínas reguladoras que controlan la replicación del genoma y las proteínas estructurales que forman el virión se traducen a partir de este ARNm. La replicación del genoma del virus se realiza directamente mediante replicación de ADN.

Ejemplos: bacteriófago T4, poxvirus, herpesvirus

Grupo II: Virus ADN monocatenario (Virus ADNmc o Virus ssDNA). El ADN viral monocatenario se convierte en bicatenario, probablemente usando la maquinaria de reparación del ADN del huésped. El resto de las etapas de replicación son similares a las del grupo I. 

Ejemplos: bacteriófago phi-x174 y M13

Grupo III: Virus ARN bicatenario (Virus ARNbc o Virus dsRNA). A partir del ARN bicatenario se obtiene la hebra de ARN monocatenario positivo que actúa como ARNm. La traducción de este ARNm da lugar a las proteínas reguladoras y estructurales. La replicación del genoma del virus se realiza en dos pasos. Primero se realiza un ensamblado parcial de la hebra de ARN monocatenario positivo y de las proteínas virales en viriones inmaduros. A continuación se realiza la transcripción del ARN monocatenario positivo a ARN bicatenario dentro de los viriones

Ejemplos: reovirus, picornavirus

Grupo IV: Virus ARN monocatenario positivo (Virus ARNmc+ o Virus (+) ssRNA). El ADN viral monocatenario se convierte en bicatenario, probablemente usando la maquinaria de reparación del ADN del huésped. El resto de las etapas de replicación son similares a las del grupo I. 

Ejemplos: bacteriófagos MS2 y poliovirus

Grupo V: Virus ARN monocatenario negativo (Virus ARNmc- o Virus (-) ssRNA). El  ARN  monocatenario  negativo  se  convierte  en  ARNm  (que  es  una  cadena  monocatenaria  positiva)  mediante  una transcriptasa inversa aportada por el virus. El ARNm generado se traduce en proteínas reguladoras y estructurales. Las proteínas regulan la replicación del ARN monocatenario negativo a través de una cadena de ARN monocatenario positivo que funciona a modo de molde. Estas cadenas se incluyen en los nuevos virus

Ejemplo: virus de la rabia

Grupo VI: Virus ARN monocatenario retrotranscrito (Virus ARNmcRT o Virus ssRNA-RT). ESTADOS DE UN VIRUS Estado extracelular= Inactivo Estado intracelular= Activo  Virus Bacteriófago El ADN viral entra en el núcleo de la célula, es reparado por la maquinaria de reparación del huésped y se integra en el genoma del huésped. El resto de las etapas es similar a las del grupo VI.

Ejemplos: retrovirus

Grupo VII: Virus ADN monocatenario retrotranscrito. El ADN viral entra en el núcleo de la célula, es reparado por la maquinaria de reparación del huésped y se integra en el genoma del huésped. El resto de las etapas es similar a las del grupo VI.

Cuando las células arqueobacterias y eubacterias entraron en estrés por el oxígeno liberado por otras bacterias, las cianobacterias, se asociaron para formar una nueva célula, la célula eucariota, mediante un proceso llamado simbiosis que todavía no podemos entender. 

El proceso de la multicelularidad comenzó cuando una célula se aprovechó de otras similares a ella. Un proceso que podría ser denominado estupidizar, por que se basa en negarles a esas células estúpidas la oportunidad de la transmisión a una nueva generación. Es un parasitismo distinto, ya no es el "quítate tu pa ponerme yo" de Cymothoa exigua, es un parasitismo como el de un gurú sobre los adeptos de su secta.

La libertad religiosa interfiere con el tratamiento retroviral de los infectados por VIH

Un juez en Texas ha dictaminado que dar cobertura sanitaria contra el VIH atenta contra la libertad religiosa. El argumento es enrevesado porque es difícil encajar la manera de pensar que se tenía en la edad de bronce con el derecho moderno. Lo que dice este juez es que el ObamaCare obliga a los seguros privados a dar medicación contra el VIH. Dado que... (y esto es un argumento criminal) la mayoría de los infectados son homosexuales y hay muchos cristianos evangélicos que creen en el antiguo testamento

Lev 18, 22: “No te acostarás con varón como con mujer: es una abominación”.

Lev 20, 13: “Si alguien se acuesta con varón como los que se acuestan con mujer, los dos han cometido abominación; ciertamente han de morir”.

Por lo que, obligar a dar cobertura sanitaria a homosexuales es contrario a la libertad religiosa por que, para un cristiano evangélico, tratar el Sida es contrario a sus creencias...

Hay cristianos que parece que solo se han leído el Antiguo Testamento. ¿Dónde queda el "Amarás al prójimo como a ti mismo"? Está claro que el catolicismo es mucho más integrados que estos grupos sectarios que practican la exclusión.

VIVIR PARA VER