Resultados práctica muestras de piel

La primera prueba que hicimos fue la de la catalasa. La catalasa es una enzima que proteje a las células frente al peróxido de hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno. Es util para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva).
La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre (daría falsos positivos). La producción de burbujas indica la presencia del enzima. Burbujas: catalasa positivo.

La prueba de la coagulasa. La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. Los Staphylococcus aureus patógenos dan una reacción positiva y los no patógenos negativa
Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeña con plasma y se incuba a 37 oC. Se observa la coagulación a las 4 y 24 h sin sacarlos de la estufa.

S. aureus produce dos formas de coagulasa, una que se encuentra ligada a la membrana (coagulasa ligada, ya revisada) y otra coagulasa libre.

La coagulasa libre, a diferencia de la coagulasa ligada, no cataliza la reacción directa entre fibrinógeno y fibrina, su mecanismo de acción es modificar el factor de reacción con la coagulasa a estafilotrombina, un producto semejante a la trombina. 

Estafilotrombina es el factor que cataliza la conversión de fibrinógeno a fibrina, que formará un coágulo rodeando las células de S. aureus impidiendo que las células inmunológinas del hospedador entren en contacto con la bacteria e inicien la fagocitosis.

A la izquierda tenemos a S. aureus que produjo coagulación y a la derecha tenemos a S. epidermidis que no produjo coagulación. La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre. La coagulasa está estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria.

La siguiente prueba será la presencia de DNasa. Algunas bacterias excretan nucleasas que despolimerizan el DNA. Se hace una estría gruesa una placa conteniendo DNA. Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado

A la izquierda tenemos S. epidermidis y a la derecha S. aureus.

Prueba del manitol. Los Staphylococcus aureus producen colonias amarillas con zonas amarillas, mientras que coagulasa-negativo Staphylococcus producen colonias rojas o ligeramente rosadas sin cambio alguno al medio. Si un organismo es capaz de fermentar el manitol, un subproducto ácido es creado que hace que el rojo de fenol cambie a amarillo. Se usa para el aislamiento selectivo de colonias de Staphylococcus sospechosas de ser patógenas

Prueba de resistencia a la novobiocina. Sirve para distinguir S. saprophiticus de S epidermidis. Un disco de papel con una carga de 5 microgramos permite diferenciar Staphylococcus saprophiticus que es resistente, de Staphylococcus epidermidis. Como el 98% de los estafilococos coagulasa negativos aislados en clínica son de las especies S. epidermidis y S. saprophyticus, el uso dos pruebas sencillas. Coagulasa (S. aureus es coagulasa +) y sensibilidad a novobiocina facilita la identificación de los estafilococos patógenos.

Arriba S. epidermidis, abajo S. saprophiticus

Prueba MRSA: Distingue entre S. aureus con resistencia a la meticilina y S. aureus sensibles a la meticilina o otros Staphylococcus como S. epidermidis. Utilizamos una placa cromogénica para detectar MRSA.

Tinción de Gram:

Pregunta 1: ¿Por qué tiene color dorado el S. aureus? ¿Qué función tienen generalmente estos pigmentos?

El color amarillo es debido a pigmentos carotenoides. La síntesis de productos coloreados por parte de los microorganismos es una característica determinada genéticamente. Su formación en muchos microorganismos es dependiente de la presencia de la luz, composición del sustrato y la temperatura de incubación. La presencia de pigmentos en las bacterias que medran en hábitats sometidos a la luz les confieren un efecto protector frente a la luz visible y el ultravioleta cercano. Los carotenoides se localizan en la membrana plasmática y protegen a la célula de la fotooxidación, su presencia confiere a las bacterias colores que van desde el tono amarillo al rojo.

Pregunta 2: Queremos distinguir S. aureus de Streptococcus pyogenes. Los crecemos en agar sangre y realizamos la prueba de la catalasa. ¿Por qué debemos tener cuidado cuando tomamos una colonia de no tomar agar sangre?

La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre ya que los eritrocitos poseen catalasa, lo cual nos daría falsos positivos.

Pregunta 3: ¿Qué le pasa al ADN cuando añadimos ácido clorhídrico? ¿Qué efecto tiene la DNasa en el este efecto?

El ADN precipita en contacto con el ácido clorhídrico. La DNasa al degradar el ADN éste desaparece y por tanto no precipita y crea un halo alrededor de las bacterias productoras de DNasa. 

Pregunta 4: ¿Qué es un falso positivo o un falso negativo?

Solución

Pregunta 5: ¿Por qué S. aureus crea un halo a su alrededor cuando crece en agar sangre?

Debido a que produce la beta hemólisis de la sangre. Imagen. Podemos diferenciar tres tipos de hemólisis: Hemólisis alfa: es una hemólisis parcial y la zona de crecimiento aparece rodeada de un halo de color verdoso Hemólisis beta: en este caso la hemólisis es total y el halo que rodea a las colonias es totalmente transparente. Hemólisis gamma (no hemólisis): el microorganismo en cuestión no es capaz de realizar la hemólisis y por tanto no existe halo alrededor de la colonia.

Pregunta 6: ¿Por qué el agar manitol salado es un medio selectivo? ¿Por qué el color salmón del medio vira a amarillo?

Solución. Las bacterias Gram negativas suelen tener menos sales en su interior que las Gram positivas. Por ese motivo, las Gram - no logran sobrevivir en estos ambientes ya que mueren por deshidratación debido a la fuerte pérdida de agua generada por la diferencia en el potencial osmótico.Si un organismo es capaz de fermentar el manitol, un subproducto ácido es creado que hace que el rojo de fenol cambie a amarillo. Se usa para el aislamiento selectivo de colonias de Staphylococcus sospechosas de ser patógenas

Pregunta 7: ¿Cómo puedo distinguir entre las bacterias Staphylococcus coagulasa negativo?

La novobiocina es un curioso y viejo antibiótico natural (obtenido en 1956) al que se reconocen varios tipos de mecanismos de acción, que al haberse aislado de varias fuentes ha recibido varios nombres. Un disco de papel con una carga de 5 microgramos permite diferenciar Staphylococcus saprophiticus que es resistente, de Staphylococcus epidermidis que es sensible al antibiótico. Como el 98% de los estafilococos coagulasa negativos aislados en clínica son de las especies S. epidermidis y S. saprophyticus, el uso dos pruebas sencillas. Coagulasa (S. aureus es coagulasa +) y sensibilidad a novobiocina facilita la identificación de los estafilococos patógenos.