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martes, 10 de noviembre de 2020

Práctica infecciones de vías respiratorias

El tracto respiratorio se extiende desde las fosas nasales hasta los alvéolos pulmonares, está

habitado por diversas comunidades bacterianas. 



El aparato respiratorio comprende dos regiones: Tracto superior: cavidad nasal, faringe, laringe. El tracto inferior lo constituyen tráquea, bronquios y los pulmones.El microbioma respiratorio es dinámico y está influenciado por factores ambientales y del huésped. 

El tracto respiratorio superior está colonizado por comunidades bacterianas, virus y hongos que en conjunto forman una barrera para evitar la colonización de agentes patógenos y ayudar al entrenamiento del sistema inmune. Muchas partes se encuentran cubiertos por cilios y moco que funciona como filtro. Allí donde hay moco, como en la cavidad nasal, las enfermedades (rinitis) están asociadas a virus y no a bacterias. Las bacterias suelen colonizar lugares sin tanta segregación de moco como la faringe.


El tracto inferior carece de flora residente y es muy susceptible a enfermedades e infecciones. Los dos pulmones de un humano adulto cuentan con más de 500 millones de alvéolos, si se estirasen completamente ocuparían una superficie de 80 metros cuadrados. Los microorganismos que se pudieran encontrar son microbios “de paso” y el escalador mucociliario se encarga de expulsarlos. Hasta hace bien poco se consideraba que no deben existir microorganismos en los pulmones sanos. Gracias a los estudios de microbioma sabemos que existen bacterias en los pulmones. Las funciones de los pulmones no permitieron desarrollar barreras físicas que se presentan en otro sistemas. El intercambio de gases, calentamiento y humectación de los gases que ingresan y salen de nuestro cuerpo requieren de una capa delgada en contacto con el sistema circulatorio. 

En los pulmones solo funciona el sistema inmunológico innato a través de la actividad de los macrófagos. El sistema inmune humoral no funciona en el tracto inferior porque su actividad, que comprende la inflamación, haría que el pulmón no pudiese intercambiar gases y el individuo moriría por asfixia.
Las especies bacterianas típicas que componen la microbiota de la nasofaringe incluyen Moraxella, Staphylococcus, Corynebacterium, Streptococcus. La orofaringe está colonizado por Streptococcus, Prevotella, Neisseria, Veillonella, Rothia, Leptotrichia entre otros.


Basándonos en la secuencia del gen 16SrRNA, los estreptococos se clasifican en 5 grandes grupos: 

piógeno, mitis, angiosus, salivarus y bovis



La clasificación de los Streptococos se debe a Rebecca Lancefield. Se basa en las reacciones serológicas de los carbohidratos de la pared celular de la bacteria, es decir, en la distinta naturaleza antigénica de 
los polisacáridos de la pared
Patrones de hemólisis: La hemólisis alfa se refiere a una lisis parcial de eritrocitos que produce una coloración verde que se observa alrededor de las colonias. Esta lisis es debida a la liberación de  una alfa-hemolisina que degrada la hemoglobina dando un color verde alrededor de la colonia cuando desarrolla en agar sangre. La hemólisis beta se refiere a un halo de hemólisis completamente claro debido a Las hemolisinas que son enzimas que lisan los hematíes. Por último, la hemólisis gama se refiere a la ausencia de hemólisis. 


Grupo piógeno


En el grupo piogénico, basándonos en el tamaño grande de la colonia, en la reacción hemolítica en 

placas de sangre y en la detección de antígeno de grupo de Lancefield, es fácil identificar los e

streptococos betahemolíticos más comunes: S. pyogenes (grupo A) y S. agalactiae (grupo B)


S. pyogenes

S. pyogenes no presenta grandes problemas en su identificación. Se trata de colonias betahemolíticas, 

que generalmente son sensibles a la bacitracina. S. pyogenes. Inhalación de partículas de enfermos y 

portadores (humanos, perros y otros animales de compañía). Se diseminan por tos, estornudos, comida

y bebida contaminadas. Algunas cepas de S. pyogenes pueden estar infectadas con fagos (producen 

toxina speA ) y producir fiebre escarlatina.


S. agalactiae

Existen varios medios de cultivo selectivos para la detección de S. agalactiae, recomendados para el 

cribado de colonización por estreptococos del grupo B en mujeres embarazadas. El medio Granada 8 es 

de interpretación sencilla y tiene una sensibilidad y especificidad elevadas. Se basa en la detección del 

pigmento carotenoide que expresa la mayoría de los estreptococos de este grupo. El crecimiento de 

colonias de color naranja, tras incubación en anaerobiosis, nos indica la presencia de S. agalactiae. Hay 

que tener en cuenta que, aproximadamente, un 5% de los aislamientos suelen ser cepas no hemolíticas y 

no pigmentadas, por lo que no serían detectadas con este medio.


Grupo mitis


S. pneumoniae

Las colonias de neumococo son características, producen alfahemólisis (por peróxido de hidrógeno) y, 

si se prolonga algo la incubación de las placas, el centro de las colonias aparece ligeramente deprimido 

como resultado de la autólisis

.

Se identifican presuntivamente por su sensibilidad a la optoquina, junto a su solubilidad en sales biliares y una reacción catalasa negativa. Su diagnóstico etiológico se recomienda la tinción de Gram y el cultivo de esputo. Cuando se observan menos de 10 células escamosas y aparecen más de 25 polimorfonucleares por campo a 100 aumentos (grados IV y V de Murray y Washington) el esputo es adecuado

 


Muchas cepas de Streptococcus pneumoniae viven comensales en el tracto respiratorio superior. ¿Por qué de repente se vuelven infecciosos y colonizan los pulmones? S. pneumoniae, cuando detecta virus en su ambiente aumenta el número de su población y desarrolla una capa mucosa que le permite colonizar el pulmón y evitar a los macrófagos. La capa mucosa o cápsula es un factor de virulencia y su presencia o ausencia sirvió para demostrar en 1944 que el ADN era la molécula portadora de la herencia genética.


Objetivo de la práctica


Identificación de Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae por medio de sus características bioquímicas y patrón de sensibilidad antimicrobiana.


Alcance

La práctica cubre desde la obtención de una muestra de calidad (exudado faríngeo y nasal),

transporte, procesamiento hasta el reporte e interpretación de resultados (fases preanalítica,

analítica y post analítica).


Aparatos, equipos e instrumentos: microscopio óptico, mechero Bunsen, incubador 37º e incubador 37º 

C, 5%-7% CO2




Recursos adicionales
Caldo de cultivo Todd Hewitt con cepas bacterianas de Streptococcus pneumoniae (x9).
Caldo de cultivo Tripticasa Soya con cepas bacterianas de Streptococcus pyogenes (x9).

Descripción del procedimiento

SESION 1

1. Etiquetar en la base de una caja bipetri “S. pneumoniae” en una mitad y “S. pyogenes” en la
otra mitad.

2. Realizar técnica de estriado en la caja bipetri de sangre de S. pneumoniae y S. pyogenes,
en sus respectivas mitades para obtener colonias aisladas.
2.1. Sumergir el asa bacteriológica estéril en la solución bacteriana.
2.2. Realizar el estriado. NO VOLVER A TOMAR MUESTRA ENTRE ESTRIADOS.

3. En una segunda caja bipetri con agar sangre etiquetar en la base “S. pyogenes”. En una

mitad etiquetar “optoquina” y en la segunda mitad “bacitracina”.

3.1. Repetir el proceso con S. pneumoniae en una tercera caja bipetri.


4. Realizar técnica de cultivo en “césped” en la caja de S. pneumoniae y en la de S. pyogenes.

4.1. Sumergir un hisopo estéril en la suspensión bacteriana.

4.2. Eliminar el excedente presionando el hisopo contra las paredes del tubo antes de

retirarlo.

4.3. Pasar el hisopo por el agar sangre realizando un zigzag muy cerrado. Girar 90° y volver

a realizar el procedimiento.


5. Colocar los discos de antibióticos en sus respectivas mitades.

5.1. Calentar la punta de las pinzas al rojo vivo y dejar enfriar.

5.2. Tomar con cuidado un disco de optoquina y colocarlo en la mitad del agar.

5.3. Calentar la punta de las pinzas al rojo vivo y dejar enfriar.

5.4. Tomar con cuidado un disco de bacitracina y colocarlo la mitad del agar.

5.5. Repetir el proceso con la otra caja bipetri con cultivo en césped.




6. Cada equipo de trabajo debe realizar una toma de muestra nasofaríngea y orofaríngea.

6.1. Etiquetar la base de una caja Petri con agar sangre con “Nasofaríngeo” y “Orofaríngeo”.

6.2. Tomar la muestra de acuerdo a la técnica explicada



Hisopado orofaringeo y nasofaringeo (min. 3:20). Fuente: PAHO TV


Exudado faríngeo.

El cultivo faríngeo es el método estándar para documentar la presencia de S. pyogenes en la

faringe, esta prueba alcanza una sensibilidad del 90 a 95%.

Condiciones previas del paciente

• El paciente no debe haber recibido antibióticos en los últimos 8 días, previos a la obtención de

la muestra.

• El paciente debe acudir en ayunas al laboratorio.

• Debe cepillarse los dientes y no practicar gargarismo.


Procedimiento

1. Inspección de la faringe: ubicar al paciente en una posición cómoda y con buena iluminación,

deprimir la lengua con el bajalenguas, visualizar la fosa amigdalina y faringe en busca de

exudado posterior, presencia de pseudomembrana o placas


2. Indicar al paciente que abra la boca y que pronuncie un largo “ah”, el cual sirve para elevar

la úvula y evitar las náuseas.

3. Introducir el hisopo y frotar enérgicamente ambas amígdalas y la pared posterior de la faringe

con movimientos de barrido.

4. Retirar el hisopo cuidando de no tocar las paredes laterales de orofaringe, úvula, lengua,

encías y dientes.

5. Extender la muestra con suaves movimientos sobre la superficie de los portaobjetos para

realizar los frotis que serán teñidos al Gram.

6. Obtener un segundo hisopado de fauces para la siembra en Agar Sangre de carnero, Girar

la cabeza del hisopo y presionar ligeramente contra una zona pequeña del extremo de la

caja Petri.

7. Estriar por agotamiento con un asa previamente esterilizada para obtener colonias aisladas.

8. Incubar el agar sangre a 37°C, en condiciones de 5-7% CO2, por 24-72 horas.


Observación: En caso de ser necesario, la muestra se podrá transportar en medio de Stuart o

Amies, realizando el cultivo de la misma en el menor tiempo posible (menos de 2 horas).

Interpretación del examen directo


Gram: describir los hallazgos de células inflamatorias, la morfología y disposición bacteriana

presente (ejemplo: cocos Gram positivos en cadena, bacilos Gram negativos fusiformes) así

mismo reportar la presencia de células levaduriformes, hifas y pseudohifas.


SESIÓN 2


1. Bipetri estriada con S. pneumoniae y S. pyogenes:


1.1. Observar las características morfológicas de las colonias.

1.2. Hemolisis de cada una de las cepas.

1.3. Realizar la prueba de catalasa de ambas cepas bacterianas.

1.4. Reportar resultados en la Tabla de características microbiológicas observadas.


2. Bipetris con discos antibióticos: interpretar resistencia y susceptibilidad a los antibióticos

optoquina y bacitracina.


2.1. Medir diámetros de los halos (si los hay).

2.2. Registrar los resultados y su interpretación (Resistente o Susceptible) en la Tabla de

respuesta a antibióticos.

3. Muestras nasofaríngea y orofaríngea:

3.1. Identificar las características morfológicas de cada una de las colonias aisladas

(escoger mínimo dos morfologías diferentes)

3.2. Realizar tinción Gram.

3.3. Realizar prueba de catalasa.

3.4. Con los datos obtenidos identifique de manera presuntiva el género y la posible especie

de las bacterias aisladas.

3.5. Registrar resultados en la Tabla de características morfológicas y microbiológicas de

muestras nasofaríngeas y orofaríngeas.


Datos a ser registrados y el método de análisis y de presentación de resultados.



Género Streptococcus: una revisión práctica para el laboratorio de microbiología



Cuestionario: 


PREGUNTA 1: ¿Mediante qué mecanismo S. pneumoniae lisa los eritrocitos?


PREGUNTA 2: ¿La clasificación de Lancefield en qué está basada?


PREGUNTA 3: ¿Por qué el patrón de hemólisis es útil para clasificar estreptococos?


PREGUNTA 4: En referencia a las características generales de los Streptococcus. Señale la opción 

correcta. Puede haber más de una opción correcta o ninguna. Justifique cuando 

una opción es incorrecta:


a) Son cocos Gram-positivos agrupados en cadena.

b) Tienen crecimiento rápido y forman colonias al cabo de 24-36 horas de cultivo.

c) Sólo pueden oxidar los azúcares, no pueden fermentarlos.

d) Son bacterias con mínimos requerimientos nutricionales y pueden crecer en medios pobres.

e) Dan reacción positiva a la prueba de la catalasa.

f) Se las denomina fastidiosas porque las cepas con importancia médica desarrollan más

lentamente.

g) Una de las especies beta hemolíticas con mayor importancia médica es S. pneumoniae.


a) Correcta, en cadenas y en diplococos

b) Correcto. Aunque pueden aparecer cultivos tras 18 horas

c) Correcto, los bacilos son fermentadores de lactosa

d) Verdadero, se las puede cultivar en medio solidos

e) Falso. Todas las especies de Streptococcus son catalasa negativa y Staphylococcus son catalasa 

positivo

f) Verdadero, S. pneumonie puede ser considerada una bacteria fastidiosa ya que tiene requerimientos 

nutricionales específicos

g) La más importante Beta hemolíticos es Streptoccocus pneumoniae


PREGUNTA 5: ¿Por qué el patrón de hemólisis es útil para clasificar estreptococos?


Resultado: Porque nos permite dividir a los Streptococcus según su patrón de lisis de los eritrocitos. 

Existen Streptococcus alfa hemolíticas que producen una hemólisis incompleta, existen Beta 

hemolíticos que producen una hemólisis completa y los gamma hemolíticos que no producen 

hemólisis, 


PREGUNTA 6: En referencia a las características generales de los Streptococcus pyogenes. En todas 

los casos señale la opción CORRECTA. Puede haber más de una opción correcta o ninguna. Justifique 

cuando una opción es incorrecta:


a) La proteína M y las exotoxinas SpeA, SpeB y SpeC caracterizan a las cepas más patógenas.

b) Es la causa más frecuente de faringitis en niños y adolescentes de la comunidad.

c) La escarlatina es una manifestación cutánea causada por una exotoxina pirogénica.

d) Las cepas invasivas que producen SpeA pueden causar shock tóxico.

e) Causan infecciones de piel localizadas, sin diseminación a tejidos contiguos.

f) Es sensible a la bacitracina, lo que permite un reconocimiento temprano en cultivo.

g) Causa infecciones piógenas.


PREGUNTA 7: En referencia a las características generales de los Streptococcus pneumoniae. En

todas los casos señale la opción CORRECTA. Puede haber más de una opción correcta o ninguna. 

Justifique cuando una opción es incorrecta:


a) Puede integrar la microbiota normal nasofaríngea e infecta a individuos de la comunidad.

b) Su reservorio exclusivo es el humano.

c) Desarrolla en agar sangre con producción de hemólisis completa.

d) La ausencia de cápsula permite su diseminación sanguínea.

e) Existen solo 2 serotipos capsulares, A y B.


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