¿Cómo se determina el MOI óptimo para un fago?

 ¿Qué es la multiplicidad de infección o MOI?

La multiplicidad de infección o MOI representa la relación entre el número de partículas de virus y el número de células huésped en un medio de infección dado. Un valor de MOI = 1 implica que, en promedio, hay una sola célula huésped para una sola partícula de fago

Para lograr el MOI óptimo debemos de diluir el cultivo de Salmonella a una concentración de 1× 10⁸ UFC/mL. A este cultivo de bacterias se le añade una solución de fagos en proporciones de 1; 0.1; 0.01 y 0.001 respectivamente. Se cultivan durante 3 hr a 37ºC.

Posteriormente, se centrifugan los cultivos a 12000 rpm durante 10 min. Esto eliminará las células bacterianas no lisadas. El sobrenadante se filtra a través de un filtro de 0.22 micras. Eso elimina cualquier tipo de célula bacteriana dejando pasar a su través a los bacteriófagos. Se hace titulación de los fagos por el método de doble capa. El experimento se repite tres veces. Se selecciona la dilución que proporciona la mayor concentración de fagos como el MOI óptimo (1)

 

Fig. 1 Resultados para un fago lítico contra Salmonella. En el eje de la Y tenemos el número de fagos obtenidos despues de haber incubado durante 3 hr distintas MOI del fago (1, 0.1, 0.01 y 0.001) con 1× 10⁸ UFC/mL de Salmonella. Las unidades empleadas son en logaritmo en base 10, de manera que, por ejemplo, en la barra de la izquierda tenemos un valor ligeramente superior a 6. El logaritmo en base 10 de 1000000 de fagos es 6.  Fuente

En la figura 1 tenemos los datos publicados para un fago de Salmonella, que emplearé como ejemplo. Los resultados indican que la titulación del fago fue, de izquierda a derecha en la tabla de: 1.2×10⁶ UFP/mL, 3.7× 10⁸ UFP/mL,  2.8× 10⁹ UFP/mL y 3.4× 10⁶ UFP/mL para las diluciones de fagos de MOI 1, 0.1, 0.01 y 0.001. Conclusión, el MOI que favorece que a las 3 horas haya más fagos es MOI = 0.01, es decir, por cada fago hay 100 bacterias disponibles.

Curva de crecimiento en un paso

Este tipo de curva se basa en un método préviamente descrito (2). A un cultivo de Salmonella con una densidad óptica de...... se le añadieron fagos para tener una MOI óptica de 0.01, como se calculó arriba. Se incuba durante 5 min. a 37ºC. Este tiempo es para facilitar que el fago se una a la bacteria. Se centrifuga la mezcla a 12000 rpm durante 10 min. Se elimina el sobrenadante y el pellet se lava dos veces con medio LB. Finalmente el pellet se resuspende en un volumen similar y se incuba a 37ºC con una agitación de 180 rpm. Cada 10 min se toman 100 µl durante tres horas y se diluyen en medio LB y se calcula la titulación de los fagos mediante cultivo en doble agar. El tiempo entre la absorción del fago y el momento en el que ocurre la lisis bacteriana se define como PERIODO DE LATENCIA. Para determinar el número de fagos que salen de una ronda de lisis en Salmonella, tomamos el número medio de fagos finales y se divide por el número inicial de fagos. El experimento se repite tres veces. 

Fig. 2. 

 Como se observa en la figura 2, durante el periodo de latencia no se observa aumento de fagos. Es lo que se denomina periodo de latencia. Después de este periodo de latencia, de 10 min a 60 minutos se observa un aumento exponencial de fagos hasta alcancar un número estable de fagos a los 70 min. El tamaño medio de fagos que surgen de una Salmonella infectada por un fago es de 110 UFP. 

PREGUNTAS

1 ¿Están estos protocolos bien establecidos en su campo de estudio? es decir, hay varios laboratorios con experiencia en bacteriófagos empleándolos o es un protocolo que usan estos autores?

2 ¿Por qué un MOI de 1 es menos óptimo que uno de 0.01 en este experimento? ¿Por qué un MOI de 0.001 es menos óptimo que uno de 0.01?

3 ¿Por qué titulan la concentración de fagos cada 10 minutos en el gráfico de la figura 2?

Referencias:

1    Sui B, Han L, Ren H, Liu W, Zhang C. A Novel polyvalent bacteriophage vB_EcoM_swi3 infects pathogenic Escherichia coli and Salmonella enteritidis. Front Microbiol. 2021;12: 649673.

2     Sun WJ, Liu CF, Yu L, Cui FJ, Zhou Q, Yu SL, et al. A novel bacteriophage KSL-1 of 2-Keto-gluconic acid producer Pseudomonas fluorescens K1005: isolation, characterization and its remedial action. BMC Microbiol. 2012;12:127.

Para saber más: 

Como se titula un fago

microbiologynote.com/one-step-growth-curve-of-virus

sas.upenn.edu/LabManuals/biol275

https://www.protocols.io/view/One-step-growth-experiments-bacteriophages-x54v9mzpg3eq/v1