Escribo para mí, para recordar algunas ideas que me interesan. Con el tiempo he descubierto que existe más o menos un nexo común en esas ideas. Aviso: Este blog no es un consultorio de salud.
viernes, 30 de octubre de 2020
jueves, 29 de octubre de 2020
Resultados práctica muestras de piel
La primera prueba que hicimos fue la de la catalasa. La catalasa es una enzima que proteje a las células frente al peróxido de hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno. Es util para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva).
La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre (daría falsos positivos). La producción de burbujas indica la presencia del enzima. Burbujas: catalasa positivo.
La prueba de la coagulasa. La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. Los Staphylococcus aureus patógenos dan una reacción positiva y los no patógenos negativa
Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeña con plasma y se incuba a 37 oC. Se observa la coagulación a las 4 y 24 h sin sacarlos de la estufa.
S. aureus produce dos formas de coagulasa, una que se encuentra ligada a la membrana (coagulasa ligada, ya revisada) y otra coagulasa libre.
La coagulasa libre, a diferencia de la coagulasa ligada, no cataliza la reacción directa entre fibrinógeno y fibrina, su mecanismo de acción es modificar el factor de reacción con la coagulasa a estafilotrombina, un producto semejante a la trombina.
Estafilotrombina es el factor que cataliza la conversión de fibrinógeno a fibrina, que formará un coágulo rodeando las células de S. aureus impidiendo que las células inmunológinas del hospedador entren en contacto con la bacteria e inicien la fagocitosis.
A la izquierda tenemos a S. aureus que produjo coagulación y a la derecha tenemos a S. epidermidis que no produjo coagulación. La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre. La coagulasa está estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria.
La siguiente prueba será la presencia de DNasa. Algunas bacterias excretan nucleasas que despolimerizan el DNA. Se hace una estría gruesa una placa conteniendo DNA. Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado
A la izquierda tenemos S. epidermidis y a la derecha S. aureus.
Arriba S. epidermidis, abajo S. saprophiticus
Prueba MRSA: Distingue entre S. aureus con resistencia a la meticilina y S. aureus sensibles a la meticilina o otros Staphylococcus como S. epidermidis. Utilizamos una placa cromogénica para detectar MRSA.
Pregunta 2: Queremos distinguir S. aureus de Streptococcus pyogenes. Los crecemos en agar sangre y realizamos la prueba de la catalasa. ¿Por qué debemos tener cuidado cuando tomamos una colonia de no tomar agar sangre?
La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre ya que los eritrocitos poseen catalasa, lo cual nos daría falsos positivos.
Pregunta 3: ¿Qué le pasa al ADN cuando añadimos ácido clorhídrico? ¿Qué efecto tiene la DNasa en el este efecto?
Debido a que produce la beta hemólisis de la sangre. Imagen. Podemos diferenciar tres tipos de hemólisis: Hemólisis alfa: es una hemólisis parcial y la zona de crecimiento aparece rodeada de un halo de color verdoso Hemólisis beta: en este caso la hemólisis es total y el halo que rodea a las colonias es totalmente transparente. Hemólisis gamma (no hemólisis): el microorganismo en cuestión no es capaz de realizar la hemólisis y por tanto no existe halo alrededor de la colonia.
Tinción de Gram:
Pregunta 1: ¿Por qué tiene color dorado el S. aureus? ¿Qué función tienen generalmente estos pigmentos?
El color amarillo es debido a pigmentos carotenoides. La síntesis de productos coloreados por parte de los microorganismos es una característica determinada genéticamente. Su formación en muchos microorganismos es dependiente de la presencia de la luz, composición del sustrato y la temperatura de incubación. La presencia de pigmentos en las bacterias que medran en hábitats sometidos a la luz les confieren un efecto protector frente a la luz visible y el ultravioleta cercano. Los carotenoides se localizan en la membrana plasmática y protegen a la célula de la fotooxidación, su presencia confiere a las bacterias colores que van desde el tono amarillo al rojo.Pregunta 2: Queremos distinguir S. aureus de Streptococcus pyogenes. Los crecemos en agar sangre y realizamos la prueba de la catalasa. ¿Por qué debemos tener cuidado cuando tomamos una colonia de no tomar agar sangre?
La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre ya que los eritrocitos poseen catalasa, lo cual nos daría falsos positivos.
Pregunta 3: ¿Qué le pasa al ADN cuando añadimos ácido clorhídrico? ¿Qué efecto tiene la DNasa en el este efecto?
El ADN precipita en contacto con el ácido clorhídrico. La DNasa al degradar el ADN éste desaparece y por tanto no precipita y crea un halo alrededor de las bacterias productoras de DNasa.
Pregunta 4: ¿Qué es un falso positivo o un falso negativo?
Pregunta 5: ¿Por qué S. aureus crea un halo a su alrededor cuando crece en agar sangre?
Pregunta 6: ¿Por qué el agar manitol salado es un medio selectivo? ¿Por qué el color salmón del medio vira a amarillo?
Solución. Las bacterias Gram negativas suelen tener menos sales en su interior que las Gram positivas. Por ese motivo, las Gram - no logran sobrevivir en estos ambientes ya que mueren por deshidratación debido a la fuerte pérdida de agua generada por la diferencia en el potencial osmótico.Si un organismo es capaz de fermentar el manitol, un subproducto ácido es creado que hace que el rojo de fenol cambie a amarillo. Se usa para el aislamiento selectivo de colonias de Staphylococcus sospechosas de ser patógenas
Pregunta 7: ¿Cómo puedo distinguir entre las bacterias Staphylococcus coagulasa negativo?
La novobiocina es un curioso y viejo antibiótico natural (obtenido en 1956) al que se reconocen varios tipos de mecanismos de acción, que al haberse aislado de varias fuentes ha recibido varios nombres. Un disco de papel con una carga de 5 microgramos permite diferenciar Staphylococcus saprophiticus que es resistente, de Staphylococcus epidermidis que es sensible al antibiótico. Como el 98% de los estafilococos coagulasa negativos aislados en clínica son de las especies S. epidermidis y S. saprophyticus, el uso dos pruebas sencillas. Coagulasa (S. aureus es coagulasa +) y sensibilidad a novobiocina facilita la identificación de los estafilococos patógenos.
miércoles, 28 de octubre de 2020
Práctica muestras de piel
Clave dicotómica: aprender a discriminar
El juego de las 20 preguntas consiste en pensar que algo concreto, una cosa, persona, animal... que todo el mundo que esté jugando conozca. Las personas que jueguen tienen que adivinar qué es en menos de 20 preguntas. Las preguntas tienen que estar formuladas de manera que se pueda contestar si o no. Este juego procede del juego "Twenty questions" que se juega en los EEUU desde el SXIX. En mis clases solía jugar este juego para explicar en qué consiste la clasificación dicotómica
Una clave dicotómica se basa preguntas sobre la presencia o no de caracteres morfológicos, de estructura, composición química... De esta pregunta parten dos soluciones posibles, en función de si tienen o no tienen determinado carácter. Las mejores preguntas son las que dividen el grupo en dos subgrupos más o menos 50% y 50%. De esa manera, a base de repetir el proceso de preguntas que dividen al grupo en subgrupos 50% y 50% podemos llegar a definir cualquier organismo vivo.
Un ecosistema complejo
La piel es un ecosistema complejo y dinámico regulado por factores como la humedad, la temperatura, pH y el contenido de lípidos, habitado por bacterias, hongos y virus. Por ejemplo, se han identificado más de 1000 especies bacterianas que componen la microbiota humana. Mientras que la microbiota cutánea clásica incluye bacterias como Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis y cambia considerablemente durante la pubertad,con un mayor predominio de Corynebacterium y Cutibacterium (anteriormente Propionibacterium).
Hay tres especies principales clínicamente importantes: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus y Staphylococcus aureus. El habitante más frecuente de los tejidos de la superficie humana, incluida la piel y las membranas mucosas es S. epidermidis. Es un comensal típico de la piel, produce péptidos antimicrobianos como las modulinas solubles en fenol, que inhiben selectivamente el crecimiento de patógenos de la piel como Staphylococcus aureus y estreptococos del grupo A. Se ha demostrado que algunas cepas de S. epidermidis pueden proteger a su huésped de la colonización con S. aureus por medio de una serina proteasa.
Las enfermedades causadas por S. aureus se dividen en enfermedades piógenas localizadas o "productoras de pus" que se caracterizan por la destrucción de tejidos mediada por enzimas hidrolíticas y citotoxinas; y las enfermedades mediadas por toxinas que funcionan como superantígenos que producen enfermedades sistémicas. S. aureus, el patógeno estafilocócico clínicamente más significativo, puede causar infecciones de piel, heridas, tejido óseo, síndrome de la piel escaldada, shock tóxico e intoxicación alimentaria.
Las enfermedades causadas por S. aureus se dividen en enfermedades piógenas localizadas o "productoras de pus" que se caracterizan por la destrucción de tejidos mediada por enzimas hidrolíticas y citotoxinas; y las enfermedades mediadas por toxinas que funcionan como superantígenos que producen enfermedades sistémicas. S. aureus, el patógeno estafilocócico clínicamente más significativo, puede causar infecciones de piel, heridas, tejido óseo, síndrome de la piel escaldada, shock tóxico e intoxicación alimentaria.
Práctica distinguir S. aureus patógenos y resistentes a meticilina en muestras de piel
Objetivos de la práctica
1. Conocer el procedimiento adecuado para la toma de muestras de piel.
2. Aislar e identificar a los microorganismos responsables de infecciones de piel,
principalmente Staphylococcus aureus.
3. Diferenciar mediante técnicas microbiológicas patógenos responsables de infecciones
de piel de microorganismos propios de la flora normal como Staphylococcus epidermidis.
Aparatos: microscópios, mechero Bunsen e incubador
SESIÓN 1
Cada equipo de trabajo debe realizar lo siguiente:
Realizar la toma adecuada de un absceso o forúnculo a uno de los integrantes del equipo de
trabajo realizando el siguiente procedimiento
1. Localizar la lesión.
2. Con guantes no estériles realizar asepsia y antisepsia de la lesión con alcohol al 70%.
3. Efectuar dos hisopados de la lesión, evitar frotar con fuerza.
4. Con el primer hisopo inocular el medio ASH y estriar por agotamiento con el asa
bacteriológica, Incubar durante 24 horas a 37°C/CO 2 10%.
5. Con el segundo hisopo realizar un frotis para la coloración Gram
6. Desechar los guantes en el respectivo contenedor.
Por equipo de trabajo sembrar mediante técnica de agotamiento las cepas disponibles. (S.
aureus y S. epidermidis) y realizar las siguientes pruebas:
Caja Tripetri con Agar Sangre Humana (ASH)
Pruebas Bioquímicas en Staphylococcus sp.:
Catalasa: Colocar en el portaobjetos una gota de peróxido de hidrogeno al 3%, mediante
un palillo estéril transferir una colonia bien aislada al peróxido de hidrógeno; tener
cuidado de no tomar agar para evitar falsos positivos.
Coagulasa: Mediante un asa estéril transferir 3 colonias aisladas al tubo que contiene
plasma citratado.
Manitol: Realizar la siembra por agotamiento en la caja Petri Manitol Salado.
El medio manitol y la prueba de coagulasa se deben incubar durante 24 horas a 37°C, los
resultados de todas las pruebas mencionadas se deben reportar en la tabla descrita en la
sesión 2.
DNAsa: Cada mesa de trabajo debe sembrar con un hisopo las cepas de
Staphylococcus en el medio DNAasa bipetri haciendo una línea de por lo menos 2 cm
de longitud. Incubar durante 24 horas a 37°C.
Resistencia a la novobiocina: Realizar la siembra de cesped de S. saprophiticus y S epidermidis. Se colocan discos de novobiocina.
Prueba MRSA: se sembrará S. aureus y S. epidermidis en una placa cromogénica para detectar MRSA.
Caja bipetri con agar DNAsa – Siembra de Staphylococcus sp.
SESIÓN 2
1. Realizar tinción Gram y catalasa de por lo menos 2 colonias identificadas a partir de la
muestra sembrada en ASH.
2. En el medio DNAsa colocar 1 gota de ácido clorhídrico 1N y observar la presencia o
ausencia de un halo transparente.
Pregunta 1: ¿Por qué tiene color dorado el S. aureus? ¿Qué función tienen generalmente estos pigmentos?
Pregunta 2: ¿Por qué debemos tener cuidado cuando tomamos una colonia de S. aureus o S. epidermidis de no tomar agar sangre?
Pregunta 3: ¿Qué le pasa al ADN cuando añadimos ácido clorhídrico? ¿Qué efecto tiene la DNasa en el este efecto?
Pregunta 4: ¿Qué es un falso positivo o un falso negativo?
Pregunta 5: ¿Por qué S. aureus crea un halo a su alrededor cuando crece en agar sangre?
Pregunta 6: ¿Por qué el agar manitol salado es un medio selectivo?
Pregunta 7: ¿Cómo puedo distinguir entre las bacterias Staphylococcus coagulasa negativo?
viernes, 16 de octubre de 2020
jueves, 15 de octubre de 2020
¿Por qué meter con calzador una especie donde no pertenece?
La enfermedad de una plantita suele ser un indicativo de que la planta no está donde debiera
La enfermedad puede venir por un déficit nutricional, por un virus, un hongo o una bacteria. Estas circunstancia afectan a aquellos que están en los extremos de la distribución normal, los raritos. En las enfermedades infecciosas los individuos que tienen mayor probabilidad de infectarse y tener un desenlace complicado son siempre niños, ancianos, inmunodeprimidos o individuos que tengan una patología previa. Los extremos de la distribución normal. Si un patógeno afecta al grueso de la población ésta disminuye en número dramáticamente y ahora ese patógeno tiene que enfrentarse a un factor para el cual no estaba preparado: para la transmisión exitosa ahora que sus hospedadores están muy distanciados unos de otros.
Durante mis estudios de pregraduado asistí a una conferencia del director de un arboretum de California. En el turno de preguntas alguien se interesó por cuál era el tratamiento que le aplicaban a las especies que se enfermaban. La respuesta fue categórica: "las arrancamos para que no contaminen a otras especies" Según este botánico, que dirigía una institución con poco presupuesto, una especie se enfermaba cuando no estaba en sus condiciones óptimas. Hay tantas especies diferentes que no merece la pena luchar por mantener a una de ellas en unas condiciones que la estén estresando. Un clima mediterráneo como el de California permite la coexistencia de cientos de especies distintas. ¿Por qué meter con calzador una especie donde no pertenece?
En educación, desde la pedagogía, nos esforzamos por sacar al alumno adelante cuando a veces lo mejor sería enseñarle la puerta de salida, otros escenarios. Puede ser doloroso que un profesor te diga que no sirves para algo. Esto le pasó a un físico brasileiro que conocí. Tenía la ilusión de convertirse en maestro de ajedrez. Su profesor le desanimó de seguir ese camino. Con el tiempo reconoció que le faltaba el talento y sobre todo el perfil psicológico necesario para tener éxito en ese campo. Al dejar el ajedrez profesional y dedicarse a la física, había podido tener un trabajo en la universidad, tener hijas... y por eso le estaba agradecido a aquel profesor que lo había desanimado.
Desde la pedagogía, o desde las ciencias pedagógicas como a ellos les gusta denominarse, de manera imprecisa y bastante pedante, se irradia la idea de que no hay malos alumnos sino malos métodos o malos profesores. Y es cierto. Hay malos docentes lo mismo que hay malos alumnos. En el proceso de la enseñanza la línea de tiempo importa mucho. La mochila familiar y ambiental que llevamos cada uno, incluso la mochila cultural y étnica nos influye. El perfil psicológico, nuestro tipo de inteligencia, nuestro nivel de concentración, de empatía... también.
En la novela de Alejo Carpentier "Concierto barroco" el autor cubano subraya un hecho increíble: Vivaldi era un profesor de música en un orfanato de niñas y TODAS las niñas tocaban instrumentos musicales a nivel de un profesor de orquesta sinfónica. El criterio de selección para entrar en el orfanato era: ser huérfana. El éxito de la educación de Vivaldi fue tal que las familias poderosas presionaban para que dejasen entrar a sus hijas en el orfanato. Con un ejemplo como este no cabe más que darle algo de razón a la pedagogía, aunque todos los docentes sepamos que lo mejor que se puede hacer con ciertos alumnos es recomendarles que se dediquen a otra cosa. Quizás por culpa del alumno, quizás por culpa del sistema o por culpa de que el profesor no sea un Vivaldi en su especialidad. Me preocupa que esos alumnos sean personas mediocres, trabajando en una profesión que no le rinda frutos simplemente porque están lejos del ambiente que necesitan para florecer y tener frutos. Esta preocupación también atañe a mi persona.
Seguiremos cuidando de nuestra plantita aunque creo que nunca más dará un ají como dio cuando recién la trajimos del vivero.
El efecto de un buen docente se puede ver en la siguiente película que recomiendo:
Los Chicos Del Coro Pelicula Completa En Español1. Fuente Cardenal Quintero
Actualización del 13 de noviembre
Al final gracias a Hégira Ramírez la planta de pimiento ha dado fruto:
miércoles, 14 de octubre de 2020
Siembra, aislamiento y caracterización de bacterias
Las bacterias son pequeñas células procariotas, cuya longitud es de 0.2 a 10 μm.
La clasificación preliminar de bacterias se basa en la forma (cocos, bacilo y espirilos), disposición (pares, cadenas o grupos), propiedades específicas de crecimiento (aerobias o anaerobias, anaerobios facultativos)
resistente al ácido. Los micoplasmas son bacterias que no tienen pared celular y, por lo tanto, no se tiñen con Gram. Algunos tipos de bacterias pueden generar esporas.
Usando la tinción de Schaeffer-Fulton que contiene verde malaquita, se observan las endosporas de color verde y más pequeñas que las células activas. Fuente
El cultivo de bacterias a partir de muestras tomadas de infecciones se logra generalmente con la inoculación directa en medios de cultivo, inicialmente se realiza un inóculo primario y mediante estrías secuenciales se obtienen colonias bacterianas individuales
Técnicas básicas de Microbiología: Aislamiento y siembra en estría de una bacteria. Fuente: Área Microbiología Universidad de Salamanca
En la identificación bacteriana la morfología colonial incluye lo siguiente: Tamaño de la colonia
(generalmente medido en milímetros o descrito en términos relativos como puntual, pequeño,
mediano, grande), coloración, forma de la colonia (incluye, elevación y borde de la colonia,
aspecto de la superficie de la colonia (brillante, opaco, seco y transparente).
Además, cada bacteria tiene un metabolismo diferente lo que ocasiona diferentes cambios en
los medios de agar como resultado del metabolismo (hemólisis, cambios de pH, orificios, etc.),
cabe mencionar que ciertas bacterias producen olores distintos que pueden ayudar en la
identificación preliminar.
La práctica se realizará en dos sesiones
Se establecerá un cultivo líquido mixto para teñir con GRAM + Y GRAM -
Se crecerá Salmonella sp. y Escherichia coli en una caja bipetri
Streptococcus viridans y Staphylococcus aureus se crecerán en agar sangre.
SESIÓN 1
1. De manera individual inocular en medio sólido en caja Petri a partir del caldo de
cultivo.
1. De manera individual inocular en medio sólido en caja Petri a partir del caldo de
cultivo.
Se sembrará una mezcla de bacterias Gram +/- en una placa de agar nutritivo y se sembrarán Salmonella sp. y Escherichia coli, Streptococcus viridans y Staphylococcus aureus en una placa del medio EMB.
a. Esterilizar el asa redonda al rojo vivo en la llama azul del mechero Bunsen.
Todas las transferencias y siembras se deben ejecutar a partir de este proceso
y permanecer cerca de la zona de esterilidad del mechero.
b. Antes y después de abrir un tubo se debe flamear el borde o la boca rosca. Para
disminuir contaminaciones, se recomienda sujetar la tapa con el dedo meñique,
no dejarla sobre el mesón de trabajo.
c. Enfriar el asa en las paredes internas del tubo previo a tomar la muestra líquida.
Tener precaución de no producir aerosoles.
d. Tomar una muestra homogénea, observar que se forme una película de líquido
en la cabeza del asa redonda.
e. Flamear por última vez la boca del tubo y tapar.
f. Realizar el inóculo primario sobre el borde del agar contenido en la caja Petri y
proceder con la siembra semicuantitativa por la técnica de agotamiento.
g. Finalmente esterilizar el asa redonda, tapar la caja Petri y rotular sobre la base
de la caja.
2. Por equipo de trabajo, inocular en medios en tubo a partir de un medio sólido en
caja Petri
a. Colocar la caja Petri cerca del mechero Bunsen con la tapa hacia abajo.
b. Esterilizar el asa recta al rojo vivo en la llama azul del mechero Bunsen.
c. Destapar la caja Petri y enfriar el asa recta en una zona del agar libre de
crecimiento. Tener precaución de no producir aerosoles.
d. Tomar una muestra a partir de una colonia claramente aislada y definida. Tapar
la caja en seguida.
e. Destapar el tubo donde se inoculará. Sujetar la tapa con el dedo meñique.
f. Flamear la boca del tubo de vidrio no inoculado.
a. Esterilizar el asa redonda al rojo vivo en la llama azul del mechero Bunsen.
Todas las transferencias y siembras se deben ejecutar a partir de este proceso
y permanecer cerca de la zona de esterilidad del mechero.
b. Antes y después de abrir un tubo se debe flamear el borde o la boca rosca. Para
disminuir contaminaciones, se recomienda sujetar la tapa con el dedo meñique,
no dejarla sobre el mesón de trabajo.
c. Enfriar el asa en las paredes internas del tubo previo a tomar la muestra líquida.
Tener precaución de no producir aerosoles.
d. Tomar una muestra homogénea, observar que se forme una película de líquido
en la cabeza del asa redonda.
e. Flamear por última vez la boca del tubo y tapar.
f. Realizar el inóculo primario sobre el borde del agar contenido en la caja Petri y
proceder con la siembra semicuantitativa por la técnica de agotamiento.
g. Finalmente esterilizar el asa redonda, tapar la caja Petri y rotular sobre la base
de la caja.
2. Por equipo de trabajo, inocular en medios en tubo a partir de un medio sólido en
caja Petri
a. Colocar la caja Petri cerca del mechero Bunsen con la tapa hacia abajo.
b. Esterilizar el asa recta al rojo vivo en la llama azul del mechero Bunsen.
c. Destapar la caja Petri y enfriar el asa recta en una zona del agar libre de
crecimiento. Tener precaución de no producir aerosoles.
d. Tomar una muestra a partir de una colonia claramente aislada y definida. Tapar
la caja en seguida.
e. Destapar el tubo donde se inoculará. Sujetar la tapa con el dedo meñique.
f. Flamear la boca del tubo de vidrio no inoculado.
Tubos TSI
g. En el tubo con medio inclinado o en bisel “slant” (TSI), insertar el asa recta hasta
3 mm antes de llegar al fondo, retirar lentamente y estriar en la superficie de lado
a lado.
h. Mientras que en el tubo con medio semisólido (SIM) insertar el asa recta de3 mm antes de llegar al fondo, retirar lentamente y estriar en la superficie de lado
a lado.
manera vertical y precisa hasta 3 mm antes de llegar al fondo, retirar lentamente
i. Flamear por última vez la boca del tubo y tapar.
j. Finalmente esterilizar el asa recta, y rotular el tubo.
Inocular en medio líquido a partir del caldo de cultivo (realizar 1 de las 3 técnicas):
Inoculación con asa redonda:
a. Destapar y flamear el tubo de donde se tomará la muestra.
b. Tomar la muestra con el asa redonda previamente esterilizada, flamear y tapar
enseguida el tubo.
c. Abrir el tubo no inoculado y flamear la boca, inclinarlo y depositar suavemente el
líquido contenido en la cabeza del asa redonda contra la superficie del medio.
d. Flamear y tapar enseguida el tubo inoculado, rotular.
Inocular con hisopo:
a. Introducir el hisopo en el medio con muestra bacteriana y agitar, llevar el hisopo
al tubo no inoculado y rotar.
b. Para desechar el hisopo en cortopunzantes previamente flamear la parte
contaminada del hisopo.
Inocular con pipeta:
a. Aspirar con la pipeta Pasteur un pequeño volumen de la muestra bacteriana
previamente homogenizada y transferir inmediatamente al tubo no inoculado,
mezclar nuevamente.
b. Desechar la pipeta en el recipiente con hipoclorito de sodio al 0.5%. Flamear y
tapar enseguida el tubo inoculado, rotular.
SESIÓN 2
1. Seleccionar 1 caja petri (de las inoculadas individualmente) por equipo de trabajo y
realizar tinción Gram de 1 colonia aislada.
2 Completar la tabla a continuación en relación con las características morfológicas y
microscópicas de las colonias bacterianas aisladas
PREGUNTAS:
PREGUNTA 1: Siembro por agotamiento en estrías a partir de una colonia. Esta colonia tenía 2.5 x 10E9 bacterias. En el segundo estriado, con el asa tomo la 1/500 parte de estas bacterias. En el tercer estriado tomo la 1/100 parte de las bacterias, en el cuarto estriado 1/10, en el quinto 1/20 y el sexto y último estriado la 1/50 parte de las bacterias. ¿Cuántas bacterias tendré en el asa en el sexto estriado?
Resultado: 1/500 x 1/100 x 1/10 x 1/20 x 1/50 = 0,000000002
2.5 x 109 x 1/500 x 1/100 x 1/10 x 1/20 x 1/50 = 5 colonias
Para saber más:
martes, 13 de octubre de 2020
Cómo tomar muestras para el laboratorio de microbiología
Tomar muestras para detectar la presencia de un microorganismo que esté causando enfermedad es un proceso rutinario de los laboratorios de microbiología. Tan rutinario que a veces no tenemos en cuenta las implicaciones que las distintas rutinas tienen. La rutina dice que hay que aislar y crecer la bacteria para poder asegurarnos de cuál es el verdadero causante de la lesión o de la enfermedad. En esto se basan los postulados de Koch que podéis ver en que consisten más abajo en el post. Sin embargo, hay bacterias que no se pueden crecer en laboratorio como la que causa la lepra. Otras necesitan vivir en consorcio con otras bacterias para poder crecer. Los recientes estudios de microbioma, empleando las técnicas de secuenciación masiva, muestran que hay bacterias, como Fusobacterium nucleatum, que son coadyuvantes en la aparición de las metástasis en las células cancerígenas.
Aprendiendo a ser malas
La microbiología ha tenido que dar un salto conceptual en los años 80 del siglo pasado cuando los investigadores se dieron cuenta que había bacterias que eran comensales y no patogénicas y de repente se volvían patógenos. Lo que había ocurrido en ese caso es que la bacteria comensal había sido colonizada por algún transposón, plásmido... es decir, por un elemento genético móvil, normalmente de origen vírico, y esta bacteria pasaba de ser comensal a patógena. Esto es lo que le ha ocurido a Escherichia coli. Otro reto a la que se enfrenta la microbiología es a la aparición de bacterias resistentes a los antibióticos, y no solo eso, a la diseminación de los genes que les confieren resistencia a los antibióticos en elementos genéticos móviles como plásmidos, transposones, fagos... De esta manera bacterias ambientales que eran inocuas en el pasado se han convertido en auténticas pesadillas sobre todo en el ámbito hospitalario. Por ese motivo, de rutina, se estudian la sensibilidad a los microbianos en los laboratorios de microbiología.
Para tomar una muestra debemos tener en cuenta lo siguiente:
• Seleccionar adecuadamente el sitio anatómico de donde se obtendrá la muestra.
• Tomar la muestra utilizando la técnica adecuada.
• Colocar la muestra en un recipiente adecuado.
• Transportar la muestra al laboratorio lo más rápido posible.
• De ser necesario, almacenar los especímenes adecuadamente.
Identificación de patógenos causantes de gastroenteritis
Los postulados de Koch: la lógica al servicio de la microbiología
Es protocolo para discernir entre las muchas bacterias o agente biológicos presentes en cualquier tejido de cualquier animal. Mientras que muchas bacterias aparecen como "parásitos" de lesiones provocadas por otros agentes, solo hay un agente que provoque realmente la lesión. La importancia de los postulados de Koch consiste en la utilización de cultivos puros, cosa que es necesaria para discernir el verdadero causante de la enfermedad.
1- El agente debe estar presente en cada caso de la enfermedad y ausente en los sanos.
2- El agente no debe aparecer en otras enfermedades.
3- El agente ha de ser aislado en un cultivo puro a partir de las lesiones de la enfermedad.
4- El agente ha de provocar la enfermedad en un animal susceptible de ser inoculado.
5- El agente ha de ser aislado de nuevo en las lesiones de los animales en experimentación.
Aunque la mayoría de las bacterias infecciosas causantes de enfermedad en humanos cumplen los postulados, hay algunas excepciones. Mycobacterium leprae, causante de la lepra, no se ha podido cultivar in vitro como cultivo puro, por lo que incumple el tercer postulado. Solo se ha podido cultivar in vivo en las almohadillas de las patas de un armadillo
En los años 80 del siglo pasado se introdujo el concepto de postulados moleculares de Koch. Estos nuevos postulados sirven para probar que el fenotipo de virulencia de algunas bacterias está asociado a un gen o un grupo de genes (normalmente de origen vírico) específico. Son los siguientes:
1. Identificar un gen o producto génico que es responsable de la virulencia
2. El gen debe estar presente en el microorganismo que causa la enfermedad
3. El gen no debe estar presente en cepas avirulentas
4. Introducir el gen en una cepa avirulenta, le devuelve la virulencia
5. El gen se expresa in vivo durante la infección
6. La inmunidad específica contra el producto génico protege de la enfermedad
El caso de la bacteria que estaba donde no se esperaba que estuviese
J. Robin Warren y Barry J. Marshall, fueron premiados con el Nobel de Fisiología o Medicina de 2005 por descubrir que la bacteria Helicobacter pylori, y no el estrés, causaba las molestas úlceras de estómago. Su hallazgo tuvo unas consecuencias clínicas muy importantes. Desde que Marshall y su compañero J. Robin Warren publicaron sus investigaciones en la década de los ochenta, los pacientes aquejados de una úlcera de estómago comenzaron a ser tratados con antibióticos, que curaban estos problemas digestivos. Pero lograr aquel descubrimiento, luego premiado con el Nobel, no fue una tarea sencilla.
Según explica Marshall a Hipertextual, su intención era realizar "experimentos con humanos en algún momento" para comprobar su hipótesis. La comunidad médica había rechazado de forma mayoritaria sus ideas, ya que señalaban que las úlceras aparecían primero en el estómago y luego los microorganismos eran capaces de colonizar la zona afectada. El científico australiano defendía una hipótesis muy controvertida, según la cual Helicobacter pylori era un patógeno, no un simple comensal, que causaba los trastornos estomacales.
"Habíamos intentado inocular animales, como conejillos de indias e incluso cerdos, sin éxito. Son experimentos muy complejos, especialmente en el caso de los cerdos, porque se trata de animales muy grandes", cuenta a Hipertextual. Más tarde se dieron cuenta de que existen muy pocas especies que puedan ser infectadas con Helicobacter pylori por las proteínas que presenta.
El Nobel de Medicina de 2005 describe aquella época como "difícil", ya que la mayoría de sus artículos científicos eran rechazados o retrasados sin ninguna explicación. Movido por la frustración profesional, pero sobre todo convencido de que tenía razón, Barry Marshall decidió experimentar con la única persona dispuesta a firmar un consentimiento informado para realizar el estudio: él mismo. Así fue como acabó bebiendo una solución de bacterias en cultivo.
"Quería hacer un experimento en humanos y no podía hacerlo con el Dr. Warren porque ya había padecido la infección de Helicobacter. Yo no la había tenido nunca, así que me hice una endoscopia y todo resultó normal. Mi jefe incluso me hizo la prueba y me comentó 'que no estaba seguro de por qué me estaba realizando la endoscopia', pero me pidió que no se lo contara", dice Marshall durante la entrevista.
Unos días después de la realización de la endoscopia, el científico se bebió las bacterias en cultivo que había extraído de un paciente anteriormente aquejado de la infección y que había sido curado. "Así me aseguré de que el microorganismo era sensible a los antibióticos, por lo que si desarrollaba la úlcera me iba a poder curar", afirma.
Decidido a confirmar sus hipótesis, por arriesgados que fueran los experimentos —Helicobacter pylori aumenta el riesgo de padecer cáncer de estómago—, Marshall incluso evitó comentarle lo sucedido a su esposa. "Era una de esas ocasiones en las que era mejor pedir perdón que permiso", escribió el científico cuando recibió el premio Nobel.
Una semana después de beber la solución de bacterias, el investigador empezó a sufrir vómitos y a padecer una gastritis muy grave. Al realizarle una nueva biopsia, sus compañeros se dieron cuenta de que Helicobacter pylori había colonizado por completo el estómago de Marshall. Así fue como el joven médico desterró al estrés como la causa de las úlceras. En realidad era una bacteria capaz de vivir en un ambiente tan extremo como el entorno ácido del estómago la que las producía. Marshall había encontrado por fin la causa de las úlceras y, lo más importante, conseguía demostrar que eran curables con antibióticos, al igual que sucede con otras infecciones bacterianas.
Detección de bacterias: aislarlas allí donde se concentran
Las pruebas de laboratorio se suelen hacer a partir de muestras de urocultivos, hemocultivos, coprocultivos, cultivos de muestras respiratorias, biopsias a partir de heridas y cultivo o detección de antígenos del líquido cefalorraquideo (LCR). Se obtienen de estos sitios porque o bien las aislamos del foco en donde están generando problemas, como es el caso de las biopsias de heridas, o bien de los conductos en donde circulan fluídos en el cuerpo humano: urea, sangre, heces, aire o LCR.
Conceptos bien importante en el aislado de las bacterias es evitar la contaminación cruzada con otras bacterias y el transporte de la muestra desde el sitio de recogida hasta el laboratorio para evitar que crezcan bacterias que contaminen la muestra y hagan la lectura del agente causante de la enfermedad complicada.
Para tomar una muestra debemos tener en cuenta lo siguiente:
• Seleccionar adecuadamente el sitio anatómico de donde se obtendrá la muestra.
• Tomar la muestra utilizando la técnica adecuada.
• Colocar la muestra en un recipiente adecuado.
• Transportar la muestra al laboratorio lo más rápido posible.
• De ser necesario, almacenar los especímenes adecuadamente.
Urocultivos
En un urocultivo se considera una bacteriuria como "significativa" o lo que es lo mismo una infección urinaria si se recuentan más de 100.000 UFC/ml de orina. Es lo que se conoce como criterio de Kass.
Clean Catch Urine of Specimen Collection Series with Dr. Michael Miller
I 701 Collecting a Midstream Urine Sample
¿Sabes como se realiza el procedimiento de urocultivo y orina completa?. Fuente: El ciudadano TVCoprocultivos
How to collect a fecal specimen: for patients. Fuente Alpha-Tec Systems
El medio de transporte es el medio Cary Blair. Este medio mantiene el pH óptimo y un bajo potencial de oxido-reducción. Como carece de nutrientes la muestra no sufre modificaciones en el número de bacterias.
En los coprocultivos es clave la utilización de medios selectivos. Las heces tienen un contenido tan elevado de bacterias que poder discriminar las patógenas de las comensales es clave
Fuente: Microbiología e inmunología. TextbookKafir4. Ed. Marbán
Luego, con un simple test bioquímico podemos diferencias entre los distintos enteropatógenos utilizando el agar Kliger
Cultivos de heridas
WCW: Wound Biopsy. Fuente: WebCME
I705 Collecting a specimen for wound culture. Fuente: Skills lab
Clinical Connections- Wound Culture Techniques. Fuente: WebCME
La técnica Levine, como pudimos ver en el video, es mejor para la recolección de la bacteria causante de la infección.
Procedimiento para realizar cultivos cuantitativos con hisopos (método de Levine)
• Limpiar la herida con solución salina normal.
• Quitar /limpiar de tejido no viable.
• Esperar de dos a cinco minutos.
• Si la úlcera está seca, humedezca el hisopo con solución salina normal estéril.
• Cultive el tejido de aspecto más saludable de la herida.
• No cultivar exudado, pus, escaras o tejido muy fibroso.
• Gire el extremo de un aplicador con punta de alginato estéril sobre un área de 1 cm2 durante 5 segundos.
• Aplique suficiente presión al hisopo para hacer que se extraiga el líquido tisular.
• Utilice una técnica estéril para romper la punta del hisopo en un dispositivo de recolección diseñado para cultivo cuantitativo
Cultivo de sangre
Phlebotomy Procedure: Venipuncture with 21G Butterfly. Fuente: Crystastic Jewels
Blood Culture Collection Steps | Blood Collection (Rx-TN). Fuente: Sunsoars
Toma de muestra para Hemocultivo-Universidad Santo Tomas. Fuente: Flavio Salazar
Cultivo de muestras respiratorias
Identificación de patógenos causantes de neumonía, faringitis y otras infeeciones respiratoriasCultivo de líquido cefalorraquídeo (LCR) y detección de antígeno capsular en LCR
Diagnóstico de microorganismos causantes de meningitis purulentas (meningitis bacteriana) y fúngicas (Criptococcus neoformans). Las muestras pueden ser sometidas a concentración bacteriana si existen niveles bajos de bacterias o virus, o amplificar mediante la detección de antígeno capsular.PREGUNTAS:
PREGUNTA 1: Se toma una muestra de coprocultivo. Carecemos del medio de transporte Cary Blair, se utiliza como sustituto un medio generalista. ¿Cómo puede esto afectar al posterior análisis?
a) No afecta en absoluto. Los medios de transporte son exclusivamente para transportar bacterias
b) No afecta en absoluto porque aunque pueda que crezcan las bacterias lo harán todas por igual y los ratios entre bacterias no se verán afectados
c) Afecta ya que en un coprocultivo existen bacterias que tienen distintos ratios de crecimiento y eso puede afectar al análisis ya que al aportar nutrientes las bacterias crecerían.
d) Las bacterias si no se transportan en un medio Cary Blair corren el riesgo de morir y eso afectaría al posterior análisis en el laboratorio
e) El medio generalista al no ser específico hace que crezcan las bacterias y puedan intercambiar plásmidos y ADN extracromosómico provocando la aparición de cepas nuevas y esto indudablemente alteraría el análisis subsiguiente
Resultado: c) Afecta ya que en un coprocultivo existen bacterias que tienen distintos ratios de crecimiento y eso puede afectar al análisis ya que al aportar nutrientes las bacterias crecerían.
Para saber más
García-LechuzMoya JM, González López JJ, Orta Mira N, Sánchez Romero
MI. Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras
en el Laboratorio de Microbiología. 2017. 1b. Sánchez Romero MI
(coordinadora). Procedimientos en Microbiología Clínica. Cercenado
Mansilla E, Cantón Moreno R (editores). Sociedad Española de
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). 2017.
Método Levine. • National Pressure Ulcer Advisory Panel, European Pressure Ulcer Advisory Panel and
Pan Pacific Pressure Injury Alliance. Prevention and Treatment of PressureUlcers:
Clinical PracticeGuideline. Emily Haesler (Ed.). Cambridge Media: Osborne Park,
Western Australia; 2014. Página 185.
Zurita, Jeannete. Recolección y Transporte de Muestras en Microbiología Clínica. Organización Panamericana de la Salud Primera Edición 2004.
Fusobacterium se adhiere a los azúcares de las células cancerosas
La bacteria Fusobacterium nucleatum pertenece a las bacterias Gram negativas, anaerobias y de aspecto filamentoso tiene un tropismo hacia la glucoproteína superficial Gal/GalNAc que se encuentra en algunas células cancerosas
Al localizarse junto a estas células cancerosas promueven que las células secreten proteínas inflamatorias o «citocinas», en concreto interleucina-8 y CXCL1, que promueven la migración de las células cancerosas, uno de los pasos en la metástasis.
La secuenciación masiva está cambiando la microbiología. Ahora podemos detectar el ADN de la bacteria asociado a procesos patológicos como el cancer. En la microbiología clásica dependíamos de la toma de muestra, esto es, de poder aislar la bacteria del proceso infeccioso. ¿Pero qué ocurre como en el caso del cancer que no hay una sospecha de que exista bacterias asociadas? pues que no se tomaba muestra. Es la historia de Helicobacter pilori, que no se sospechaba que creciese en el estómago y fuese la causante de las úlceras gástricas. Si no sospechamos de que una bacteria esté implicada en ese proceso no nos tomamos la molestia de tratar de aislarla. Además, la mayoría de las bacterias no crecen en los medios de cultivo de bacterias usuales. Por esa razón estábamos viendo solo la punta del iceberg. Ahora solo queda probar los postulados de Koch para asociar Fusobacterium a las causas que generan la metástasis.
Para saber más:
https://www.investigacionyciencia.es/noticias/nuevo-actor-en-la-metstasis-19104
Kapatral, V.; Anderson, I.; Ivanova, N.; Reznik, G.; Los, T.; Lykidis, A.; Bhattacharyya, A.; Bartman, A.; Gardner, W.; Grechkin, G.; Zhu, L.; Vasieva, O.; Chu, L.; Kogan, Y.; Chaga, O.; Goltsman, E.; Bernal, A.; Larsen, N.; D'Souza, M.; Walunas, T.; Pusch, G.; Haselkorn, R.; Fonstein, M.; Kyrpides, N.; Overbeek, R. (2002). «Genome Sequence and Analysis of the Oral Bacterium Fusobacterium nucleatum Strain ATCC 25586». Journal of Bacteriology 184 (7): 2005-18. PMID 11889109. doi:10.1128/JB.184.7.2005-2018.2002.
«Fusobacterium nucleatum in Periodontal Health and Disease». Current Issues in Molecular Biology. 2011. doi:10.21775/cimb.013.025.
Mor, Gil; Kwon, Ja-Young (2015). «Trophoblast-microbiome interaction: a new paradigm on immune regulation». American Journal of Obstetrics and Gynecology 213 (4): S131-7. doi:10.1016/j.ajog.2015.06.039.
Todar, K. «Pathogenic E. coli». En University of Wisconsin–Madison Department of Bacteriology, ed. Online Textbook of Bacteriology. Consultado el 30 de noviembre de 2007.
Han, Y. W.; Redline, R. W.; Li, M.; Yin, L.; Hill, G. B.; McCormick, T. S. (2004). «Fusobacterium nucleatum Induces Premature and Term Stillbirths in Pregnant Mice: Implication of Oral Bacteria in Preterm Birth». Infection and Immunity 72 (4): 2272-9. PMID 15039352. doi:10.1128/IAI.72.4.2272-2279.2004.
Hillier SL, Krohn MA, Rabe LK, Klebanoff SJ, Eschenbach DA (1993). «The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women». Clinical Infectious Diseases. 16 Suppl 4: S273-81. PMID 8324131.
Hitti J, Hillier SL, Agnew KJ, Krohn MA, Reisner DP, Eschenbach DA (2001). «Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor». Obstetrics and Gynecology 97 (2): 211-9. PMID 11165584.
Kostic, Aleksandar D.; Chun, Eunyoung; Robertson, Lauren; Glickman, Jonathan N.; Gallini, Carey Ann; Michaud, Monia; Clancy, Thomas E.; Chung, Daniel C.; Lochhead, Paul; Hold, Georgina L.; El-Omar, Emad M.; Brenner, Dean; Fuchs, Charles S.; Meyerson, Matthew; Garrett, Wendy S. (2013). «Fusobacterium nucleatum Potentiates Intestinal Tumorigenesis and Modulates the Tumor-Immune Microenvironment». Cell Host & Microbe 14 (2): 207-15. doi:10.1016/j.chom.2013.07.007.
jueves, 8 de octubre de 2020
Tinción de Ziehl-Neelsen
El diagnóstico definitivo de las enfermedades infecciosas causadas por micobacterias se basa en la demostración de su agente etiológico. Esto se consigue, entre otras formas, por histopatología, mediante la tinción bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) en los tejidos obtenidos in vivo o en la autopsia. La Tinción de Ziehl-Neelsen sirve para teñir Nocardias y Mycobacterium, bacterias con una cubierta cerosa.
Las colonias de Mycobacterium tuberculosis son cerosas, de una consistencia casi seca, lo que da a entender lo impermeables que son estas bacterias.
La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias.
Preguntas:
PREGUNTA 1: ¿Qué ocurre con la tinción de Ziehl-Neelsen cuando las preparaciones se dejan tiempo prolongado en el alcohol-ácido, en vez de 1 min, 30 minutos?
a) No le ocurre nada excepto que las bacterias no alcohol/HCl pueden desaparecer
b) Que el carbol fucsina desaparece
c) Que el azul de metileno no puede penetrar
d) Que el cristal del portaobjetos se degrada con el ácido
e) Que hay que volver a calentar el portaobjetos
Solución: a)
PREGUNTA 2: En el protocolo dice que hay que dejar el alcohol ácido sobre el portaobjetos de 1 a 2 minutos. Si no se da el tiempo suficiente de decoloración ¿Qué ocurre?
a) Otras bacterias y contenidos del frotis pueden retener la carbol fucsina, dando como resultado falsos positivos
b) El azul de metileno puede retenerse en las bacterias alcohol/HCl resistentes
c) El carbol fucsina no penetra en las células dando falsos negativos
d) La carbol fucsina se difumina y no se retiene creando una imagen con una resolución satisfactoria
e) Se le castiga al laboratorista colgándole dos horas de los dedos gordos de los pies
miércoles, 7 de octubre de 2020
Tinción de Giemsa: teñir tejidos y células sanguíneas
Frotis Sanguíneo y Tinción de Giemsa. Fuente SFPIE UV
Lectura de frotis de sangre periférica. Fuente
La tinción de Wright es un tipo de tinción usada en histología para facilitar la diferenciación de los tipos de células de la sangre.
Tinción de Giemsa: Todos estos colorantes se encuentran en estado no ionizado mientras se mantienen en solución de alcohol metílico, pero al añadir agua se ionizan y se unen selectivamente a los constituyentes celulares precipitando como sales insolubles.
Los componentes celulares de naturaleza aniónica (ácida) se unen selectivamente a los tintes catiónicos tiñéndose en variados tonos de azul. Estos componentes son llamados basófilos: (ADN, mitocondrias, ribosomas y citoplasma de células ricas en ARN).
Los componentes celulares de naturaleza catiónica (básicos) se unen selectivamente al tinte ácido eosina, tiñéndose en variados tonos de naranja y rojo. A estos elementos se los denomina acidófilos o eosinófilos. Este es el caso de la hemoglobina, y de las proteínas contenidas en las granulaciones de los granulocitos eosinófilos.
Diferenciar las eubacterias en dos bloques: tinción de Gram
Clave dicotómica: aprender a discriminar
El juego de las 20 preguntas consiste en pensar que algo concreto, una cosa, persona, animal... que todo el mundo que esté jugando conozca. Las personas que jueguen tienen que adivinar qué es en menos de 20 preguntas. Las preguntas tienen que estar formuladas de manera que se pueda contestar si o no. Este juego procede del juego "Twenty questions" que se juega en los EEUU desde el SXIX.
En mis clases solía jugar este juego para explicar en qué consiste la clasificación dicotómica
Una clave dicotómica se basa preguntas sobre la presencia o no de caracteres morfológicos, de estructura, composición química... De esta pregunta parten dos soluciones posibles, en función de si tienen o no tienen determinado carácter. Las mejores preguntas son las que dividen el grupo en dos subgrupos más o menos 50% y 50%. De esa manera, a base de repetir el proceso de preguntas que dividen al grupo en subgrupos 50% y 50% podemos llegar a definir cualquier organismo vivo.
Tinción de Gram: distingue a los dos grandes grupos de bacterias
Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se tiñen de una forma u otra, lo que permite diferenciar las bacterias en dos bloques: Bacterias Gram positivas y las Gram negativas, de gran utilidad para elegir un determinado tratamiento antibiótico.
Así, las bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se denominan Gram negativas. Están formadas por una pared más fina formada por menos capas de peptidoglicano y una segunda membrana rica en lípidos (que repele la tinción Gram), al microscopio aparecen incoloras. La belleza de está técnica radica en que las eubacterias se dividen en Gram positivas y Gram negativas, es decir, lo que discrimina esta técnica de tinción son los dos grandes grupos en los que se dividen las eubacterias.
Las Gram positivas suelen ser cocos, es decir, bacterias esféricas debido a su mayor turgencia (presión interna) y las Gram negativas bacilos, es decir, con forma de bastones
¿Cómo teñir?
El cristal violeta se une a la pared bacteriana y se estabiliza con el lugol. La mezcla alcohol-acetona disuelve la membrana externa de las bacterias Gram negativas (más fina que la de las Gram positivas) extrayéndose el cristal violeta. Después se tiñen solo las Gram negativas con safranina.
Pasos para realizar la tinción Gram
1 Tomamos bacterias con el asa y las diluímos en una gota de agua sobre el portaobjetos. Dejamos secar
2 Gota de violeta cristal durante 1 min.
3 Lavamos con agua
4 Gota de lugol (yodo) durante 1 min.
5 Lavamos con agua
6 Lavamos con alcohol 5-10 seg.
7 Lavamos con agua
8 Gota de safranina durante 1 min.
9 Lavamos con agua y secamos. Ponemos un cubreobjetos y al microscopio.
La pared celular, clave en la tinción de Gram
Las eubacterias como las Gram positivas y negativas son bacterias que tienen una alta concentración de sales en su interior y por ese motivo tienen una elevada presión osmótica. Aproximadamente las Gram positivas tienen 25 atm de presión interna y las Gram negativas entre 1 y 5 atm. Para evitar que esta presión haga explotar su membrana plasmática, ésta está rodeada de una capa de peptidoglicano.
Como se observa en la figura la capa de peptidoglicano en las Gram positivas es cinco veces más grande que en las Gram negativas ¿Puede ser porqué las Gram positivas tienen 5 veces más presión interna? ¡Por supuesto!
La estructura de la pared celular se compone de azúcares (NAG también llamada N acetil glucosamina y NAM o N acetil murámico) y de un puente entre las mureínas de aminoácidos unidos por enlace peptídico.
La pared celular tiene que estar entrelazada para que sea una malla efectiva e impida que la célula explote debido a su turgencia o presión interna.
La penicilina impide que la pared celular forme una malla y eso provoca que la célula literalmente explote.
Preguntas:
PREGUNTA 1: El distinto comportamiento en la tinción de Gram ¿A qué crees que es debido? (pueden ser una o varias respuestas)
a) a las diferentes capas superficiales o paredes de las bacterias que tienen los distintos tipos de célula.
b) A la cantidad de fosfolipidos que tienen la gram negativas es mayor que las gram positivas.
c) A los peptidoglicanos, que es mayor en las gram positivas que en las gram negativas.
d) A las distintas formas que tienen las bacterias
e) A los distintos comportamientos mótiles, no mótiles, ameboides de las bacterias
Resultados: a, b y c
PREGUNTA 2: ¿Qué ocurre cuando usamos el objetivo de 100X y no usamos aceite de inmersión?
a) se reduce significativamente la dispersión de la luz
b) se incrementa la resolución de la imagen
c) Se reduce la resolución de la imagen
d) se forma una película viscosa entre el objetivo y el cubreobjeto
e) Puede rayarse el objetivo con el cubreobjeto
Solución: c) Se reduce la resolución de la imagen
Recursos:
https://learn.chm.msu.edu/vibl/content/gramstain.html
https://virtuallab.tlc.ontariotechu.ca/intro.php
Laboratorio virtual – AMRITA
No corre en Chrome, hay que descargar el navegador Firefox y descargar Adobe Flash Player.
Tiene simulaciones de casi todo, pero no es interactivo
Lab virtual de micro 1: https://vlab.amrita.edu/index.php?sub=3&brch=73
Lab virtual de micro 2: https://vlab.amrita.edu/index.php?sub=3&brch=76
https://learn.chm.msu.edu/vibl/content/gramstain.html
https://virtuallab.tlc.ontariotechu.ca/intro.php
Laboratorio virtual – AMRITA
No corre en Chrome, hay que descargar el navegador Firefox y descargar Adobe Flash Player.
Tiene simulaciones de casi todo, pero no es interactivo
Lab virtual de micro 1: https://vlab.amrita.edu/index.php?sub=3&brch=73
Lab virtual de micro 2: https://vlab.amrita.edu/index.php?sub=3&brch=76