Prueba de difusión en disco (Kirby Bauer)

Prueba  de sensibilidad antimicrobianos por difusión en disco. Método de Kirby Bauer

Se realizarán el experimento de Prueba de difusión en disco (Kirby Bauer). Esto es el experimento que realizarán los aliumnos. Cultivos bacterianos de Escherichia coli en placas Petri con Agar Nutritivo. En el cultivo de E. coli se colocarán discos de los siguientes antibióticos: ampicilina/sulbactan; ampicilina; cefazolina, ciprofloxacina y gentaminican. 

El descubrimiento de sustancias para controlar el crecimiento y reproducción bacteriana fue un evento revolucionario para la terapéutica médica. Sin embargo, el uso de agentes antimicrobianos promovió la selección de aquellas poblaciones bacterianas que lograron desarrollar mecanismos para evitar los efectos nocivos que estas sustancias provocan. Los mecanismos de resistencia a los antibióticos están determinados por cambios genéticos que se transmiten entre las poblaciones bacterianas de forma vertical (a las siguientes generaciones) y de forma horizontal (entre poblaciones de la misma generación a través, principalmente, de la conjugación). Es así que la resistencia a antibióticos es uno de los principales problemas a los que se enfrentan los sistemas de salud a nivel mundial. Los médicos tienen la responsabilidad de seleccionar y usar los medicamentos antibióticos más apropiados basando su decisión en el conocimiento integral de la problemática. Por esto, es fundamental que el estudiante de medicina conozca los principios y técnicas que permiten determinar si una población bacteriana es sensible o resistente a los antibióticos. Estas técnicas se conocen como pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos Kirby Bauer

Objetivos de la práctica

1. Conocer el procedimiento para realizar una prueba de difusión en disco.
2. Identificar las variables que pueden influir en los resultados de una prueba de difusión en disco.
3. Interpretar los diámetros de la zona de inhibición como sensible, intermedio o resistente
para cada bacteria basados en las recomendaciones del CLSI.

Alcance

Esta práctica cubre desde la preparación del inóculo hasta la interpretación de los resultados
obtenidos en el antibiograma, caracterizando a las poblaciones bacterianas analizadas como
susceptibles o resistentes a los diferentes antibióticos probados.

Aparatos, equipos, materiales y reactivos

Mechero bunsen, incubadora 37ºC, turbidímetro calibrado.

Cuantificación de bacterias en medio líquido

Nefelometría y/o Turbidimetría son métodos analíticos basados en la dispersión de partículas suspendidas en líquidos. En bacteriología nos sirven para saber cuántas bacterias tenemos en un cultivo líquido.

Turbidimetría: es la medición de la luz transmitida a través de una suspensión, tiene la ventaja de permitir la valorización cuantitativa, sin separar el producto de la solución. Las mediciones, pueden efectuarse concualquier espectrofotómetro.

Nefelometría: mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz emitida (generalmente con ángulos que oscilan entre 15 y 90º). Utiliza como instrumento el nefelómetro (en el que el detector se ubica con un ángulo que oscila entre 15 y 90º ej. a 90º). Se suele utilizar para concentraciones más diluidas. Permite mayor sensibilidad con concentraciones menores de partículas suspendidas. Constituye un método más exacto para la medida de la opacidad.

¿En que se basan? Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. En la turbidimetría se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del que llega a la disolución. En cambio, en la nefelometría la medida de la intensidad de luz se hace con un ángulo de 90º con respecto a la radiación incidente. Para medir la nefelometría se utiliza el estándar de McFarland:

0.5 McFarland equivale a un cultivo de 1.5 x 10⁸ bacterias E. coli/ml

Cuantificación de bacterias en medio sólido

PROBLEMA 1. Tengo un cultivo celular de una densidad óptica de 0.6. Sabemos que:

La concentración de bacterias en un cultivo = DO600nm x 1.2 10⁹.

Por tanto, la concentración de bacterias será 0.6 x 1.2 10⁹ = 7.2 10⁸. Si tengo 7.2 10⁸ bacterias por militro ¿Cuántas diluciones 1/10 tendría que hacer para tener un número en la placa que pudiese contar? Para entender las diluciones mira el siguiente gráfico:

Si tengo un cultivo líquido de E. coli y en el nefelómetro mido 0.5 McFarland, lo que me dice la teoría es que 0.5 McFarland  corresponde a 1.5 x 10 ⁸ bacterias/ml. La teoría nos dice que: 

Entonces... si mido ese cultivo de E. coli en un espectrofotómetro a 600nm teóricamente tendría un valor entre 0.08 y 0.1. Imaginemos que tengo 0.9. La teoría nos dice que si tengo 

D.O.600nm = 0.1

Entonces: número de bacterias/ml = D.O.600nm x 1.2 x 10⁹ 

número de bacterias/ml = 0.1 x 1.2 x 10⁹ = 1.2 x 10⁸.

Si divido 1.2 x 10⁸ / 1.5 x 10⁸ = hay un 20% menos bacterias teóricas por el método de espectrometría comparado con el de nefelometría. ¿Es eso cierto?

 

SESIÓN 1

1. De cada cultivo bacteriano seleccionar 1 colonia, con el asa

bacteriológica con mucho cuidado tomar la colonia y disolverla en un tubo que contenga

2mL con solución salina al 0.9%.

2. Ajustar la turbidez al estándar McFarland 0.5 en el Turbidímetro hasta alcanzar la

concentración deseada (0.5 McFarland).

3. Introducir un hisopo estéril en el tubo con solución 0.5 McFarland, eliminar el exceso del

líquido en las paredes del tubo, posterior inocular la superficie del agar MH con el hisopo

sobre toda la superficie de agar (I); gire la placa aproximadamente 60 grados y repetir el

procedimiento por 2 ocasiones más (II y III), tomar en cuenta que se debe cubrir toda la

superficie del agar para garantizar una distribución uniforme del inóculo. Para finalizar la

inoculación pasar el aplicador por la periferia del medio de cultivo (IV).

Minuto 2:20 a 2:55 método de siembra

4. Permitir secar el medio por un lapso de 3 a 5 minutos y no más allá de 15 minutos.

5. Colocar los discos de antibióticos sobre el agar con una pinza estéril previamente

flameada. Oprima los discos suavemente con la pinza para asegurar un buen contacto

con el medio de cultivo. Los discos deben estar espaciados de manera que su distancia

a la pared de la placa sea de 15 mm y entre ellos de 20 a 30 mm.

Discos de antibióticos utilizados

6. Incube en aerobiosis a 37°C-24 horas.

Resultados:

Recursos adicionales:

Método Kirby-BauerURL 

 

ID Laboratory Videos - Antibiotic Susceptibility Testing

Para saber más:

El antibiograma como recurso para explicar la evolución

Prueba de BLEE

Resultados práctica antimicrobianos

Los antibióticos sólo deben de matar bacterias

¿Qué podemos hacer para combatir la resistencia a los antibióticos?

Cómo la avicultura india está creando superbacterias globales

El problema de las resistencias a los antibióticos (también en Ecuador)