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| El test de Ames es un método sencillo y barato de comprobar la capacidad mutágena de un compuesto |
En la prueba de AMES se utiliza una cepa de la bacteria Salmonella typhimurium, la cual es auxotrófica para histidina (incapaz de crecer en ausencia de histidina) y se expone al agente químico en un medio deficiente de histidina. Después de incubar se observan las colonias desarrolladas, mismas que serán mutantes capaces de crecer en un medio sin histidina. Actualmente dos nuevas características se han incluido en la prueba AMES:
La primera es que la cepa de la bacteria usada carezca de enzimas reparadoras del DNA, lo que previene la corrección del daño del DNA.
La segunda es la incorporación de preparaciones enzimáticas de hígado junto con el reactivo químico de prueba, debido a la evidencia de que estas enzimas convierten muchos agentes químicos nocarcinógenos en carcinógenos.
1- Marcamos cuatro cajas del medio agar-mínimo-glucosa-sales como sigue:
a) Control positivo
b) Control negativo
c) Desconocido
d) Opcional
2. Preparamos cuatro tubos conteniendo 2 ml de Top-agar y los mantenemos fundidos a 45°C.
3. Inoculamos un tubo de Top Agar con 0.1 ml de Salmonella typhimurium. Mezclamos rápidamente en un agitador vortex, a baja velocidad por 3 segundos, o rotando el tubo con las manos (no permitir que se solidifique el agar).
4. Vertemos rápidamente el medio inoculado en la caja del control positivo de medio agar-mínimo-glucosa-sales.
5. Repetimos la inoculación con la bacteria, para cada uno de los tres tubos restantes, uno por uno, vaciando en las cajas restantes.
6. Con unas pinzas estériles colocamos un disco de papel filtro estéril en el centro de la caja del control positivo. Con una pipeta depositamos una gota de 4-NOPD sobre el papel para que se sature. Presionamos suavemente sobre el papel con la punta de la pipeta, para que el disco quede bien adherido al medio.
7. Colocamos un disco de papel en la placa del control negativo. Humedecemos el disco con agua estéril.
8. En la placa del compuesto desconocido colocamos un disco de papel impregnado con un compuesto a probar.
9. Si la sustancia a probar es cristalina, colocamos unos cuantos cristales directamente sobre el agar, en el centro de la caja.
10. Incubamos todas las placas a 37°C por 48 horas. Determinamos si hay desarrollo de mutantes estimulados por los compuestos probados, alrededor del papel filtro. Explicamos el tipo de sustancias probadas y su posible relación con la aparición de mutantes.
APÉNDICE
Medios especiales utilizados:
I. Medio Agar mínimo-glucosa-sales:
(Se prepara mediante la mezcla de Medio Vogel-Bonner E 50X, más glucosa sales y agar).
a) Medio Vogel–Bonner E 50X:
H2O destilada 670 ml
MgSO4 .7H2O 10 gr
Ácido cítrico monohidratado 100 gr
K2HPO4anhidro 500 gr
NaHNH4PO4.4H2O 175 gr
Referencia:
Hace muchos años había estudiado estas cosas; me ha gustado especialmente este post al ver que ese inteligente test sigue usándose.
ResponderEliminarEn aquella época había visto que la reversión a prototrofia se ensayaba también en medios conteniendo lisados hepáticos (creo recordar) en el caso de mutágenos potenciales ingeridos para tener en cuenta si lo eran, si podían dejar de serlo tras la desintoxicación hepática o si, por el contrario, ésta promovia agentes neutros a agentes mutagnénicos. En aquella época había una revista que se llevaba la palma en estas cosas, Mutation Research.