Práctica PCR región ITS de Candida albicans

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Introducción

Objetivos de la práctica

Realizar el montaje experimental de la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR). Conocer el fundamento teórico y las aplicaciones de la reacción de PCR.

Alcance

Esta práctica de laboratorio comprende el ensamblaje de la reacción de PCR y el corrimiento de la misma en un termociclador, el DNA resultante, amplicones, se almacenará para su visualización en gel de electroforesis en la siguiente práctica.

Requisitos previos a la realización de la práctica

Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá realizar una lectura sobre el fundamento teóricoectura sobre el fundamento teórico de la reacción en cadena de la Polimerasa y la guía de práctica. Al inicio de la práctica se realizarán preguntas acerca de las lecturas.

Video 1: en las células la duplicación del ADN es un proceso complejo en el que toman parte muchas enzimas. En la PCR, la duplicación es extremadamente sencilla y la única enzima responsable del proceso es la Taq polimerasa

Materiales

Antes de empezar la práctica tenemos que tener todos los materiales, como se observa en la fotografía. Los reactivos tienen que estar en una gradilla térmica a baja temperatura

Tenemos el buffer + dNTPs + Taq polimerasa alicuoteados en tubos eppendorf

Método

Reacción para 1 tubo de PCR:

Primer 1                            1.25 ul

Primer 2                            1.25 ul

Buffer+dNTPs+Tag 2x        

dH20

Total                                    23 ul

Se le añade 2 ul de ADN

Como vamos a hacer 1 muestra tenemos que tener, además de esta muestra, un control positivo con ADN de Candida albicans y un control negativo con agua destilada. Para evitar el exceso de pipeteo hacemos un Mix multiplicando la reacción para 1 tubo x 3.5

Programa DITS 

95º 5min

35 ciclos

94º 1m

51º 1 min 20 seg

72º 1m

Cuando acaben lo 35 ciclos hay un paso adicional

72º 10min

Y luego el termociclador mantiene las muestras a 10ºC

Primers

ITS1 5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´

ITS4 5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´

Secuencia ITS4 reversa 5´GCATATCAATAAGCGGAGGA 3´

The DNA fragment amplifed with these primers includes the 5.8 subunit and two intergenic spacers of ribosomal DNA.

>LC601821.1 Candida albicans IFM 4953 genes for 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA, partial and complete sequence

TGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGATTTGCTTAATT
GCACCACATGTGTTTTTCTTTGAAACAAACTTGCTTTGGCGGTGGGCCCAGCCTGCCGCCAGAGGTCTAA
ACTTACAACCAATTTTTTATCAACTTGTCACACCAGATTATTACTTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGG
ATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGT
GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGT
TTCTCCCTCAAACCGCTGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGACTTGGGTTTGCTTGAAAGACGGTAGTGGTA
AGGCGGGATCGCTTTGACAATGGCTTAGGTCTAACCAAAAACATTGCTTGCGGCGGTAGCGTCTACCACG
TATATCTTCAAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAG
GAA

Tamaño del fragmento ampliado 537 nt

Visualización de la PCR: electroforesis en gel de agarosa

En vez de TBE nosotros vamos a utilizar un buffer similar: TAE. 

El colorante que va a teñir en la electroforesis de agarosa, al final del protocolo, es SYBR Green de Invitrogen. El DNA Ladder BenchTop 100 bp es de Promega

Referencias:

Identification of Candida Species by PCR Identification of Candida Species by PCR

Evaluation of internal transcribed spacer region of ribosomal DNA sequence analysis for molecular characterization of Candida albicans and Candida dubliniensis isolates from HIV-infected patients

Ejercicios:

EJERCICIO 1:  ¿Por qué cuando preparamos el master mix y añadimos la Taq polimerasa no mezclamos utilizando el vortex?

EJERCICIO 2:  ¿De qué depende la temperatura de annealing o unión de los primers? Explique. 

EJERCICIO 3: ¿Qué ocurre cuando utilizamos una temperatura de anillamiento 20 ° C menor de la temperatura de anillamiento recomendada?

EJERCICIO 4:  ¿Por qué es recomendable usar material nuevo y estéril para PCR? ¿Qué tipo de consecuencias podríamos tener? Pon un ejemplo.

EJERCICIO 5:  Si hacemos una amplificación de ADN mediante PCR ¿Cuál será el control negativo y cuál el positivo?

EJERCICIO 6: Tengo que preparar un master mix siguiendo la siguiente receta: 

Master mix (volumen final por tubo de reacción = 50 ul)

Ingrediente/tubo                                                                                             Cantidad/tubo

    Taq                                                                                                                        0,2 ul

    MgCl2                                                      50mM                                                  1   ul

    dNTPs                                                      10mM                                                  2   ul

    Primers                                                     10µM                                            2   ul c/ primer

    Tampón de reacción                                 10X                                                      5   ul

    Agua bidestilada o ultrapura                                                                             35,8 ul

Sin embargo, es imposible coger un volumen de 0.2 ul porque las pipetas grises, las que se emplean para volúmenes pequeños sólo pueden trabajar entre 0.5 ul y 10 ul, siendo el menor volumen que pueden tomar con cierta precisión 0.5 ul. ¿Cómo resuelves este problema?

EJERCICIO 7: Tenemos que hacer un gel de agarosa de 200 ml. Tenemos que añadir SYBR Green. El stock de SYBR es 10.000X. ¿Cuántos ul (microlitros) de SYBR tenemos que añadir a la agarosa?

Solución: 2O ul (microlitros)

EJERCICIO 8: Tenemos 25 ul de una PCR. ¿Cuánto Blue Juice 10x tengo que añadir? a) para un volumen final de 20 ul b) para un volumen final de 30 ul

EJERCICIO 9: Hemos hecho un gel de agarosa de 200 ml. Cuando vamos a ponerlo en la cubeta nos damos cuenta de que otro grupo la está utilizando. Ya no hay cubeta grande, solo hay una cubeta pequeña y nuestro gel no entra porque es demasiado grande. ¿Qué hacemos? a) Les rompemos la cabeza y les robamos la cubeta. Aprovechamos para echarle la culpa de la agresión a uno de los compañeros que no vino hoy a la práctica b) Si hay una cubeta más pequeña cortamos el gel para que quepa c) entro en negación y me da un ataque de ansiedad y lloro. Esa circunstancia de estrés psicológico hace que no pueda realizar la práctica por un problema médico. Presento un certificado médico y arreglado. Señala la opción correcta

Solución: 

EJERCICIO 10: Analiza por qué no ha salido nada en estos dos geles de agarosa de PCRs. En cada gel se cargaron 4 muestras: DNA ladder, muestra PCR + a partir de un ADN de Candida conocido, PCR - de agua destilada y nuestra muestra clínica problema. ¿Por qué no se ve ni siquiera el DNA ladder? Nota: si has hecho este ejercicio, el ejercicio 11 te sorprenderá

EJERCICIO 11: Se hizo una PCR, cargó en un gel (A), con el transiluminador del laboratorio de prácticas no se vio nada (B). Esto nos hizo pensar ¿Y si ese transiluminador no es lo suficientemente potente para poder visualizar el ADN? No habíamos comprobado que el transiluminador funcionaba bien, por eso, utilizamos el transiluminador del laboratorio de ómicas. Gracias a este aparato pudimos obtener el resultado (C). ¿Qué se ha aprendido de este proceso?

EJERCICIO 12: Hemos cargado este gel de agarosa ¿Es correcta la orientación? Razona tu respuesta

EJERCICIO 13: Tenemos 25 ul de una PCR. ¿Cuánto Blue Juice 10x tengo que añadir? a) para un volumen final de 20 ul b) para un volumen final de 30 ul

EJERCICIO 14: ¿Qué reactivos se necesitan para una PCR? Imaginemos que tienes que amplificar una región del genoma de Candida albicans

EJERCICIO 15: ¿Qué ocurre cuando utilizamos una temperatura de anillamiento 20 ° C menor de la temperatura de anillamiento recomendada?Pregunta 5:
a) Identifica el ORF en esta secuencia de ADN
5' TATGTTTTATAAAGTCGGATATCTAACCCTTGTCACGTATTTCATGCGCGATGG 3'
¿Cuántos nucleótidos totales tiene ese ORF?

EJERCICIO 15: ¿Por qué es necesario poner la marca de los aparatos que estamos utilizando en la práctica? Por favor, relaciona con la imagen de la pregunta 1

EJERCICIO 16: Quiero hacer un gel de agarosa de 150 ml. ¿Cuánto SYBR green tengo que añadir teniendo en cuenta que está a una concentración 10.000X?

EJERCICIO 17: Tenemos que hacer tres PCRs: dos controles, unos positivo y otro negativo y la muestra que queremos amplificar. Para evitar el pipeteo innecesario hago un mix para los tres tubos. ¿Cuánta cantidad de cada producto tengo que añadir?

Mix (Buffer, dNTPs, Taq polimerasa) 2X 12.5 ul

Primer 1 1.25 ul

Primer 2 1.25 ul

dH2O 8 ul

-------------------------

23 ul

A esto se le añade 2 ul de la muestra

EJERCICIO 18: ¿Por qué bajamos la temperatura del termociclador para que se produzca el anillamiento? ¿Por qué la subimos a 72º en la fase de elongación o polimerización?

EJERCICIO 19: ¿En qué consiste un marcador de peso molecular para cromatografía de agarosa?

Ejemplo de respuesta incorrecta: "Es un marcador que nos permite visualizar el resultado dentro de este gel ya que lo marca este se lo incluye en la mezcla para posteriormente una vez ya finalizado el proyecto podamos identificar la muestra".

Solución: el marcador de peso molecular o "DNA ladder" en inglés, es un producto que tiene fragmentos de ADN de distinto peso molecular. Se carga siempre un pocillo del gel de agarosa con 5-10 ul de este DNA ladder. Cuando encendemos la corriente, el ADN de la electroforesis se mueve hacia el polo positivo. Los ADNs de distinto tamaño del DNA ladder comienzan a separarse dependiendo de su paso molecular. 

Esto permite tener un control de tamaño de ADN para nuestra muestra. 

En el ejemplo, arriba, vemos como la banda correspondiente a nuestra muestra está entre los 500 pb y los 182 pb. Si teóricamente nuestro ADN tendría que medir 191 pb, entonces lo que observamos en el gel arriba es plausible y por tanto entendemos que nuestra PCR es correcta.

EJERCICIO 20:   Hacemos un gel de agarosa. Hay dos posibilidades a la hora de poner el gel en la cubeta. ¿Hacia dónde se orientarán los pocillos? ¿A o B? Fíjate en la posición de los electrodos. Razona tu respuesta desde un punto de vista químico

EJERCICIO 21: hacemos un master mix para 1 tubo de PCR: 

Ingrediente/tubo                                                                                             Cantidad/tubo

    Taq                                                                                                                        0,2 ul

    MgCl2                                                      50mM                                                  1   ul

    dNTPs                                                      10mM                                                  2   ul

    Primers                                                     10µM                                            2   ul c/ primer

    Tampón de reacción                                 10X                                                      5   ul

    Agua bidestilada o ultrapura                                                                             35,8 ul

(volumen final por tubo de reacción = 50 ul)

Sin embargo, es imposible coger un volumen de 0.2 ul porque las pipetas grises, las que se emplean para volúmenes pequeños sólo pueden trabajar entre 0.5 ul y 10 ul, siendo el menor volumen que pueden tomar con cierta precisión 0.5 ul. ¿Cómo resuelves este problema?

Solución: no tenemos pipetas que midan 0.2 ul. Sin embargo, para poder decir que una PCR es positiva o negativa tenemos que hacer paralelamente, además de la muestra clínica, dos controles. Por eso mismo, tenemos que hacer tres PCRs: la de la muestra clínica y el control positivo y el negativo. Lo que hacemos es multiplicar lo que tenemos que añadir a 1 tubo x 3.5. Así haremos un mix para tres tubos de PCR. Siempre se pone un poco más, en vez de x 3 empleamos x 3.5 para que sobre y no que falte ya que hay líquido que siempre se queda adherido a las puntas de las pipetas.

EJERCICIO 22: ¿Por qué el buffer de carga tiene glicerol? ¿Qué ocurre si cuando preparamos buffer de carga no le añadimos glicerol? ¿Para qué tiene colorante el buffer de carga?

EJERCICIO 23: Tenemos que preparar 800 ml de TAE 1X a partir de un stock de TAE 50X ¿Cómo lo harías?

EJERCICIO 24: Analiza el siguiente gel... A) ¿Se han olvidado de poner el DNA Ladder? ¿Se han olvidado de poner SYBR green? ¿Han añadido agua en vez de TAE 1X a la agarosa? ¿Ha funcionado el control + de la PCR? Por tanto, ¿Cuál es tu análisis de este gel?

EJERCICIO 25: ¿Por qué el buffer de carga tiene glicerol? ¿Qué ocurre si cuando preparamos buffer de carga no le añadimos glicerol? ¿Para qué tiene colorante el buffer de carga?

EJERCICIO 26:  A)Blue juice, DNA Ladder y SYBR green ¿Qué función tiene cada uno? B) El SYBR green tiene una concentración de 10.000X. Si tenemos que hacer un gel de agarosa de 150 ml ¿Cuánto SYBR green tenemos que añadir?