Genomic and Functional Characterization of Lytic Tlsvirus Bacteriophages Targeting Salmonella Infantis Isolated from Poultry Farms in Ecuador

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Salmonella infectada por bacteriofagos P22

Video 1. Representación de una bacteria de Salmonella infectada por bacteriofagos P22. Autor: Muyuan Chen.

Fig. 1. a) Descripción general. b) Vista de corte de un tomograma de referencia. c) Vista exterior, mostrando virus unidos a la membrana externa y el pili que se extiende fuera de ella. d) Interior de la bacteria, mostrando el ADN del virus siendo transcrito y traducido.

Fuente: Rendering protein structures inside cells at the atomic level with Unreal Engine

El tipo de interacciones condiciona qué tipo de depredador tienes

El modelo matemático del trabajo de Bisesi y colaboradores, sugiere que las bacterias que compiten entre si tienden a favorecer a los bacteriófagos generalistas, mientras que las bacterias que mantienen relaciones mutualistas tienden favorecen el fitness reproductivo de bacteriófagos especializados. En su artículo, su modelo matemático fue respaldado por resultados experimentales.

¿Tiene esto algún sentido?

Cuando vivía en Ann Arbor solía ir a Centro para el Estudio de Sistemas Complejos para escuchar seminarios de sociología bacteriana y ya había escuchado sobre un estudio similar. Las conclusiones eran que los virus competitivos eran más eficientes progresando pero hacían colapsar a los sistemas, mientras que los virus más conservadores mantenían a los sistemas complejos estables. Para darle un sentido a este tipo de estudios deberíamos utilizar una analogía. 

Imaginemos un tipo sin escrúpulos y con una pistola. ¿En qué escenario le iría mejor al tipo? A en Suiza B en un campo de refugiados...

En Suiza, un tipo con pistola y al margen de la ley sería fácilmente neutralizado por las fuerzas de seguridad por suponer una amenaza a la mínima que intentase sacarle partido al hecho de tener un arma. En un campo de refugiados, si él es el único con un arma tiene bastantes posibilidades de convertirse en el jefe de una banda que tenga acceso a extorsionar a aquellos pobres diablos estresados, asustados y sin cobertura social. De eso se trata. Cuando hay leyes, las injusticias se mantienen en el tiempo pero durante ese tiempo hay una estabilidad que te permite tener trabajo, un techo y ciertos derechos. Cuando no hay leyes... puedes resolver una injusticia de manera expeditiva. Te pueden matar, si, pero si matas a quien te está oprimiendo, pues es un problema que te quitas de encima. Ya lo dice el refrán, a río revuelto, ganancia de pescadores. Es decir, es en los momentos en los que no hay ley en donde tenemos la oportunidad de que la suerte nos favorezca y tener fortuna. Cuando los sistemas están muy regulados... es difícil salir adelante. Todo está urdido para mantener el estatus quo de quienes han hecho las leyes. 

Por eso los virus más competitivos les va bien en ambientes poco estructurados y a los virus especializados ambientes muy estructurados. Ocurre lo mismo en la selva, en donde tienes orquídeas que son fertilizadas por mariposas que solo se pueden alimentar de sus flores. 

Para saber más:

Bisesi AT, Möbius W, Nadell CD, Hansen EG, Bowden SD, Harcombe WR. 0. Bacteriophage specificity is impacted by interactions between bacteria. mSystems 0:e01177-23.

https://doi.org/10.1128/msystems.01177-23

Hitos de la terapia con fagos

1. En la República caucásica de Georgia se pueden comprar fagos sin receta en algunas farmacias del país.

2. Para 2050, al menos diez millones de personas podrían morir cada año a causa de infecciones resistentes a los antibióticos. La gran mayoría de estas muertes (hasta el 90%) ocurrirán en África y Asia, donde el uso de antibióticos está aumentando y el acceso a alternativas es deficiente. Los fagos podrían usarse para atacar microbios resistentes a los antibióticos y matarlos. Pero...

3. Ningún tratamiento basado en fagos ha llegado a las últimas etapas del proceso de ensayos clínicos.

4. Se estima que hay alrededor de 100 millones de especies diferentes de fagos, y cada una de ellas es increíblemente selectiva respecto a qué bacteria infectará. Los fagos son el "agente biológico más abundante en la tierra".

5. El pionero de la terapia con fagos, un científico francés autodidacta llamado Felix d'Herelle, intentó desertar a la Unión Soviética porque estaban invirtiendo mucho dinero en la investigación de la terapia con fagos. Pero su plan se vio frustrado cuando Stalin hizo ejecutar a su socio científico georgiano. Prudentemente decidió quedarse en Francia.

6. Las nuevas herramientas de Inteligencia Artificial pueden predecir si un fago en particular matará a un microbio en particular con tasas de "descubrimiento falso" de menos del 10%.

7. Es posible producir fagos completamente sintéticos utilizando sistemas libres de células; no se requieren bacterias. El ADN del fago primero se sintetiza químicamente y luego las "tripas" de una célula se utilizan para producir y ensamblar las partes proteicas de los bacteriófagos. Es similar a una “impresora o máquina de café expreso” para virus, y la primera terapia con un fago sintetizado mediante este método se probará en un paciente en los próximos meses.

8. Una empresa llamada LocusBio pueden agregar genes a sus fagos que no solo ayudan a modificar su rango de huéspedes, sino que también les confieren un poder adicional para matar bacterias. En un ensayo de una mezcla de fagos dirigidos a E. coli en infecciones del tracto urinario, la empresa logró una reducción de 6 log en el número de bacterias en los pacientes (lo que significa que el número de células bacterianas presentes se ha reducido un millón de veces), lo que llevó a “100 porcentaje de curación clínica” de 31 pacientes.

9. Los productos de fagos hechos a medida para la infección bacteriana de un paciente probablemente costarían alrededor de 20.000 dólares por tratamiento. Una dosis de antibióticos, por contexto, cuesta uno o dos dólares.

10. La terapia combinada, que utiliza fagos y antibióticos juntos, hace que las bacterias resistentes a los medicamentos se concentren tanto en repeler los fagos que se vuelvan sensibles a los antibióticos. 

Como los fagos persiguen a sus presas

http://www.pnas.org/content/early/2015/10/14/1508355112.abstract?sid=f29ab533-942d-441e-a367-718acf26503c

Fagos aislados en el Ecuador contra E. coli enteropatogénica y resistente a antibióticos

 

Estero Mojahuevo

 Hemos ido a buscar bacteriófagos al estero Mojahuevo en Durán, al lado de Guayaquil. 

Y los hemos encontrado :)

Fagos Mojahuevo

Ejemplos bacterianos de los cuatro tipos de interacciones

La percepción que tenemos de las bacterias como seres vivos que interactúan es muy pobre. La interacción más estudiada y por tanto la que más conocemos es su papel como causante de enfermedades. Aparte de estas interacciones patogénicas, poco sabemos de cómo interaccionan las bacterias. En mente tenemos bacterias que crecen continuamente, unas más que otras. Esto logra que unas especies, a base de crecer más que las otras, se vuelvan más abundantes. Es la imagen que se crea al reflexionar sobre la "aparición" de cepas resistentes a los antibióticos. Hay antibióticos por doquier y por ese motivo, la bacteria mutante que resiste a ese antibiótico se hace cada vez más abundante porque no hay nada que detenga su crecimiento, mientras que las bacterias sensibles al antibiótico son eliminadas con cada ronda de aplicación del mismo. Del campo de estudio de los biofilms hemos aprendido que el 99% de las bacterias viven sésiles embebidas en matrices de azúcares llamados biofilms. Los estudios sobre el microbioma también crean esta imagen de que las bacterias crecen. Unas más que otras. Si por el motivo que sea, un tipo de bacterias crece más que otras puedes tener autismo, cáncer, obesidad, depresión...

Fig. 1. A mayor número de interacciones mayor riqueza ecológica. Un principio básico de la ecología.

Las bacterias son los seres vivos autónomos más pequeños. Las defino así porque considero a los virus seres vivos. Lo que ocurre es que lo virus necesitan de células para vivir. El tipo de interacciones que tienen los virus son de dos tipos: competitivas y parasíticas. Los bacteriófagos respecto a las bacterias se comportan así. O bien tienen ciclos líticos, esto es, entran en la bacteria, se reproducen y la lisan para estar disponibles para infectar a otra bacteria, o bien, entran en una bacteria e insertan su material genético en el ADN de la bacteria, es lo que se comoce como ciclo lisogénico. Cuando sienten que la bacteria está en peligro se excinden de su ADN y se comportan como bacterias líticas. Este es un ciclo típico parasítico, ¿Por qué? porque al igual que los parásitos más conocidos, virus y bacteria comparten el espacio durante una gran parte de la vida de la bacteria. La gestión del espacio es importante en cómo interactúas con los demás. 

Las bacterias han ido más allá de la competición y el parasitismo para desarrollar simbiosis y sistemas coercitivos. La simbiosis se puede resumir en el verso del escritor uruguayo Mario Benedetti: "En la calle codo a codo somos mucho más que dos". Los sistemas coercitivos se basan en usar métodos que conviertan a células similares a ti en tus adeptos. "Ya no eres tu, ahora eres yo" mediante "El poder de uno necesita la estupidez del otro". He denominado a este tipo de interacción como coacción, o sistemas coercitivos, inspirado en los métodos sencillos de control mental que utilizan las sectas y son, a pesar de su sencillez, de una efectividad increíble.

Sospecho que la verdad de los individuos radica principalmente en como nos relacionamos con los demás. Por decirlo de una manera más clara: "Tu verdad está en el otro". Como nos relacionamos con los demás nos define poderosamente como individuos. Puede ser una relación entre iguales, puede ser una relación de dominancia en la que tu dominas al otro, o bien al contrario, que tu seas el dominado, que te acostumbres al "pegue patrón". Puede ser una relación parasítica, siendo tu el parasitado o siendo el parásito. Puedes sufrir la alienación de pertenecer a una organización que te anule como persona o anular parte de tu individualidad para formar parte de algo diferente. 

Julio Anguita puntualiza sobre la libertad del ser humano 

Si a esta clasificación basada en como te sitúas frente al otro (superioridad-igualdad-inferioridad) le sumamos la relación respecto a un espacio tenemos cuatro interacciones: competición, parasitismo, simbiosis y la coerción.

Figura 2. Ejemplos bacterianos de los cuatro tipos de interacciones

La interacción competitiva se ilustra perfectamente en el caso de Micavibrio que vamos a ver a continuación. El parasitismo se observa en el caso de Bdellovibrio. La simbiosis es más difícil de ver. Las cianobacterias y hongos que conforman los líquenes es un caso clásico, o la simbiosis que aconteció entre una Gram negativa y el arqueobacteria que dio lugar a la célula con núcleo de la que procedemos todos los protozoos, animales, plantas y hongos. 

La simbiosis se define como una relación en la que cada una de las partes participantes recibe un beneficio de esa asociación. Es una buena definición ya que permite clasificar de manera precisa este tipo de interacciones. El beneficio es un concepto que podemos manejar con soltura. Estamos habituados a ello. Hay un problema, y es cómo se gestiona la individualidad en este tipo de interacciones. Por ejemplo, la mitocondria de una célula eucariota ya no es un individuo. El hongo o la cianobacteria pueden dejar de pertenecer al líquen si la otra parte de la asociación no cumple con su trato. Si metemos un líquen en agua, el hongo deja de respirar, se muere y las cianobacterias crecen alimentándose del hongo. Lo mismo ocurre si el líquen lo tapamos y no recibe la luz del sol. El hongo se alimenta de las cianobacterias que ya no le sirven porqué no le dan los azúcares resultantes de la fotosíntesis.

¿Podemos considerar simbiosis, o debemos de considerarlo parasitismo la relación de Wolbachia con Onchocerca volvulus, el gusano responsable de la ceguera de los ríos?

Micavibrio aeruginosavorus: bacterias devoradoras de bacterias

Existen varios géneros de bacterias depredadoras de otras bacterias: Vampirococcus, Daptobacter o Micavibrio

En 1983 se aisló por primera vez de una muestra de aguas residuales Micavibrio aeruginosavorus, una pequeña bacteria que actúa como una “sanguijuela”, pegándose a la superficie de otras bacterias de las que se alimenta. El ciclo vital de Micavibrio consiste en dos fases, una primera de ataque, en la que la bacteria se mueve y busca su presa, y una segunda fase de unión en la que Micavibrio se fija de manera irreversible a la superficie de la bacteria de la que se va alimentar. Micavibrio es muy exigente con su dieta y, por supuesto, no se alimenta de cualquier cosa. Normalmente en su menú suele preferir otras bacterias tan apetitosas como Pseudomonas, Burkholderia o Klebsiella.

Micavibrio aeruginosavorus (amarillo) depredando a Pseudomonas aeruginosa (púrpura). Fuente: Daniel Kadouri, University of Medicine and Dentistry of New Jersey

Bdellovibrio, más que depredar parasita

El vídeo 1 nos muestra a Bdellovibrio, una bacteria parásita de bacterias Gram negativas ya dentro de una bacteria E. coli fluorescente. La bacteria, en negro comienza a crecer longitudinalmente. Crece por los dos extremos hasta alcanzar un tamaño que le permite dividirse en cinco bacterias hijas. Luego se ve como la bacteria fluorescente va perdiendo la fluorescencia, esto es así porque la bacteria revienta por acción de las Bdellovibrio que se liberan para así ir nadando en busca de otra víctima

 Video 1: Bdellovibrio attacking E.coli bacteria

En esta fotografía de microscopía electrónica se ve como Bdellovibrio contacta con una Pseudomonas antes de penetrar en su interior mediante un movimiento rotatorio como de sacacorchos. Abajo vemos como cuando esta bacteria entra en su víctima va arrinconando poco a poco el citoplasma de la célula depredada porque poco a poco va agotando sus recursos nutritivos formando lo que se llama Bdelloplasma. 

La célula de Bdellovibrio aumenta unas ocho veces su tamaño en el espacio periplásmico (es el espacio que en las bacterias Gram negativas está delimitado por la pared celular y la membrana plasmática). Alcanzado este tamaño se divide en varias células hijas, desarrollan otra vez el flagelo y rompen la pared celular de la exhausta víctima para nadar en busca de nuevas presas. 

Las bacterias que manipulan plantas e insectos

Las bacterias Phytoplasmas, cuando infectan ciertas plantas las convierten en zombies. Por efecto de sustancias segregadas por la bacteria, las flores se convierten en brotes apetitosos para los saltamontes. Esto esteriliza a la planta, pero eso a Phytoplasma le da igual.  Las bacterias Phytoplasma son parásitos obligados del floema de plantas. Para transmitirse de planta a planta utilizan a los insectos como vectores.

Wolbachia y la ceguera de los ríos

La matriuska genética en la enfermedad de la ceguera de los ríos

Simbiosis: cuando las cianobacterias y los hongos forman líquenes

Los líquenes son una cooperativa de hongo, algas y recientemente se ha descubierto que también de bacterias. Los hongos construyen la casa y las algas viven dentro como si fuesen la mortadela de un bocadillo. Muchos amantes del altruísmo han visto en esta asociación la prueba que valida al altruísmo como un motor de la evolución (Kropotkin, Margulis...). Pero ¿Qué hay detrás de esta imagen bucólica de comuna hippy?

Un grupo de investigadores españoles y alemanes han publicado un artículo muy interesante sobre el líquen Cetraria aculeata. Este líquen puede vivir en sitios muy muy distintos tales como las costas del Mediterraneo, las llanuras heladas de la Antártida, regiones áridas del Asia Central o la Patagonia. La mayor parte de los organismos que viven en la Antártida son incapaces de vivir en sitios calidos y soleados como el Mediterraneo.

Diversidad genética de las distintas poblaciones del hongo integrado en el líquen Cetraria aculeata (semicírculos blancos) y sus cianobacterias (semicírculos grises). El tamaño de los semicírculos es proporcional al nivel de diversidad. Los círculos de la derecha resumen los niveles de diversidad entre regiones. Fuente: Printzen et al. 2007.

Esta capacidad sorprendente de adaptación se debe a la habilidad del líquen para secuestrar o para reclutar a nuevos simbiontes que les permitan vivir en los nuevos hábitats. Muchos líquenes son capaces de crear estructuras para mantener distintas cianobacterias aisladas porque quizás juntas no se lleven bien. Para ello crean unas estructuras llamadas cefalodios. En este sentido el líquen más que funcionar como una comuna funcionaría como una pensión en donde cada huesped tendría su propia habitación. Estos investigadores descubrieron que C. aculeata cambia de simbiontes según el área geográfica en donde viva. No hay fidelidad sino puras relaciones de conveniencia

Coerción: lecciones de Myxococcus xanthus

Myxococcus xanthus preying on an E. coli colony

Los genomas de algunas bacterias, Myxococcus xanthus, Escherichia coli ejemplifican cómo la evolución ocurre por mecanismos independientes de la selección natural. La selección natural es obvia cuando se trata de organismos que dejan cadaver. Tienes una camada de perros. Al haber presión selectiva no pueden sobrevivir los 10 cachorros, por lo tanto, por probabilidad, habrá el que haga bien más tareas y que por tanto tenga la posibilidad de llegar a adulto, competir con otros adultos y ser capaz de mantener a su progenie. En el mundo bacteriano vemos ejemplos que podrían expandir esta idea de la evolución: existencia de individuos altruístas/egoístas; individuos que hacer un esfuerzo por aquellos que son como ellos (kin selection). Surge la idea de que lo que se selecciona ya no es el individuo sino el genoma. En los organismos con sexo existe cadaver. Cuando nos apareamos cada gameto baraja los genes, ocurren las recombinaciones, en la descendencia podemos ver esa variabilidad: los hermanos se parecen pero son diferentes, nacen en distinto momento según los padres sean más o menos jóvenes, con más o menos fuerza y capacidad. Sobre esa variabilidad opera la selección natural.

En el mundo de los genomas bacterianos, donde la compartimentalización genómica no está clara por la transmisión horizontal de los genes (conjugación, transformación, vesículas, transducción) ¿Cómo mantienes la independencia y la identidad de una combinación de genes exitosa? Necesitas un tag, un “identity signal”, una unidad de egoísmo.

En el mundo bacteriano se ensaya la aparición del cadaver. Si partimos de una sóla bacteria de Myxococcus xanthus y la dejamos tener, teóricamente toda la descendencia va a ser clónica ya que no existen las ventajas del sexo. ¿Podría haber mucha variabilidad intraespecífica al cabo de unas cuantas generaciones? ¿digamos un día?. Los experimentos de Lenski sugieren que puede haber mucha variabilidad intraespecífica a partir de un solo clon si se le deja tener las suficientes generaciones. Probablemente para llegar a niveles en que la variabilidad intraespecífica llegue a ser notoria hagan falta más de un día. Si a la descendencia de 24 horas de crecimiento de Myxo se la pone en una placa con escasez de nutrientes entonces la bacteria comienza a formar un cuerpo fructífero. De ser una babosa (una colonia móvil de bacterias, una especie de manada de lobos) en busca de nutrientes pasa a ser una especie de seta. La mayor parte de las células del tallo son consideradas altruistas ya que forman el tallo para que las células egoístas se coloquen en la parte superior de la estructura para poder dispersarse lejos de la zona en la que las bacterias han detectado una falta de recursos. Las células egoístas tienen mayor probabilidad de llegar a un medio favorable. Serán favorecidas por la selección natural. Lo curioso es que estas células egoístas si las dejas crecer a su vez durante 24 h volverán a formar un cuerpo fructífero con células altruistas y células egoístas.

Las células egoístas son un remedo de las células reproductivas, espermatozoides y óvulos, mientras que las células altruístas seríamos nosotros sin gónadas: un carrier que sólo trata de pasar las células egoístas a la siguiente generación buscando un background genético apropiado para mezclar genes y darle mayores oportunidades de tener éxito en su vida.

"El poder de uno necesita la estupidez del otro"

Bacterias fluorescentes

Para saber más:

Plants and Phytoplasmas: When Bacteria Modify Plants

http://www.nature.com/news/bacterial-tricks-for-turning-plants-into-zombies-1.15011

Los bacteriófagos como indicadores de la calidad del agua

En todo el mundo, al menos 2 000 millones de personas utilizan una fuente de agua potable contaminada con heces, y se prevé que en 2025 la mitad de la población mundial vivirá en zonas con escasez de agua. La disponibilidad de agua potable para todos es una de las metas de las Naciones Unidas dentro de sus Objetivos de Desarrollo Sostenible para lograr un futuro mejor y más sostenible: Objetivo 6: garantizar el acceso al agua y al saneamiento para todos.

El número de bacterias en el agua, como las bacterias coliformes y Escherichia coli, no son indicadores adecuados para evaluar la calidad virológica del agua potable. En su lugar, es más apropiado utilizar colifagos (US-EPA 2015, OMS 2017). Estos son, además, más representativos del conjunto de virus humanos que cualquier patógeno vírico.

Los colifagos son bacteriófagos que infectan bacterias fecales. Cuando abandonan los intestinos humanos por los sistemas de alcantarillado, a no ser que se encuentren con bacterias coliformes, similares a las que son capaces de infectar, no se replican. Por este motivo, son indicadores excelentes de contaminación fecal en el agua. Sobre todo para niveles bajos de contaminación, sobre todo en las aguas tratadas con cloro. Los colifagos presentan una resistencia al cloro superior a la de los enterovirus humanos.

Se están incluyendo en normativas como la nueva directiva de la UE sobre agua potable, el reglamento de la UE sobre requisitos mínimos para la reutilización del agua y el agua regenerada para el riego agrícola o también en la valoración de procesos de higienización de lodos de depuradora de aguas en las normativas nacionales francesas (orden 20/04/2021 TREL2111671A).

El método EPA 1601, desarrollado por la Environmental Protection Agency de los EEUU, es un método cualitativo de presencia o ausencia de fago. Lo interesante de este método es que implica exponer los fagos a dos tipos de bacterias entéricas para amplificarlos, es decir, que infecten esas bacterias y aumenten su número. Tras un periodo de incubación del agua en presencia de las bacterias indicadoras, las muestras deben cultivarse en placas petri, por el método clásico de doble capa, y determinar las calvas de lisis. Este método se considera el más sensible para excluir la presencia de colifagos en una muestra de aguas. El método EPA 1602 utiliza un ensayo en una sola etapa y permite cuantificar la cantidad de colifagos presentes.

En España disponemos de la UNE-EN ISO 10705-1:2002 Detección y recuento de bacteriófagos. Parte 1: Recuento de bacteriófagos ARN F específicos. (ISO 10705-1:1995) y la UNE-EN ISO 10705-2:2002  Detección y recuento de bacteriófagos. Parte 2: Recuento de colífagos somáticos.

Para saber más:

 https://higieneambiental.com/aire-agua-y-legionella/los-bacteriofagos-ganan-interes-como-nuevos-indicadores-de-la-calidad-del-agua

Un bacteriófago lisando E. coli

Un bacteriófago puede lisar un fago directamente o puede insertarse en su genoma

El ciclo lítico es una relación competitiva entre el fago y la bacteria. El ciclo lisogénico es una relación parasítica

Prácticas de Microbiología. Inducción del profago λ mediante luz ultravioleta. Vídeo 11

Para saber más:

https://www.madrimasd.org/blogs/microbiologia/2019/05/12/132417

Purificación fagos por ultracentrifugación

 

Protocolo para purificar fagos con gradiente de sucrosa pincha aquí

1    Centrifugar el lisado en la centrífuga Sorvall Lynx 4000 a 5.000 rpm, 5 min, 4ºC. Deseche el precipitado.

2     Agregue Triton X-100 a los sobrenadantes del lisado para obtener una concentración final del 1 % (de un stock del 10 ó 20 %). 

3     Centrifugar el lisado en la ultracentrífuga Sorvall WX Ultra Series a 17 000 rpm, 50 min, 4 ºC. Deseche los sobrenadantes. 

4     Resuspender los sedimentos de virus con un pequeño volumen de Tris-HCl 50 mM, pH 7,8 *Aproximadamente 1,0 mL por 100 mL de lisado 

5     Coloque la suspensión de virus en capas sobre gradientes de sacarosa lineales de 100-400 mg/ml (10-40 %) equilibrados con Tris-HCl 50 mM fabricados en tubos de polipropileno (capa de aproximadamente 3-4 ml por gradiente). 

*Para hacer reservas de sacarosa, agregue 10-40% de sacarosa a Tris-HCl y autoclave. 

6     Centrifugar los gradientes en la ultracentrífuga a 20.000 rpm, 20 min, 4ºC. El virus será la banda principal entre 1/2 y 2/3 de profundidad en el gradiente. 1 

7     Retire las bandas de virus de los gradientes con agujas estériles y transfiéralas a tubos de centrífuga de polipropileno de 30 ml. Dividir el virus de 3 gradientes entre dos tubos. Diluya lentamente el virus al volumen del tubo con Tris-HCl 50 mM. Centrifugar los tubos en la ultracentrífuga a 27.000 rpm, 3 horas, 4ºC. Deseche los sobrenadantes. 

8     Resuspender los sedimentos de virus con un pequeño volumen de Tris-HCl 50 mM. Conservar el virus a 4ºC. No congelar. Se recomienda la esterilización por filtración utilizando un filtro de acetato de celulosa de 0,45 um.

Plasmid DNA Extraction (CsCI Isolation). Fuente: Abnova

Phage isolation and concentration by cesium chloride (CsCl) gradient. 

Colibactinas presentes en la carne roja y procesada provocan cáncer colorectal

La colibactina es un metabolito genotóxico producido por Escherichia coli y otras bacterias entéricas, es decir, que viven en el intestino humano. Las colibactinas causan mutaciones que conducen al cáncer colorrectal y la progresión del cáncer colorrectal. La colibactina es un péptido poliquétido que puede formar enlaces cruzados entre hebras en el ADN.

Fig. 1. Colibactina. Fuente

La colibactina solo es producida por cepas bacterianas que contienen una isla genómica de policétido sintasa (pks) o un grupo de genes biosintéticos clb. Alrededor del 20 % de los humanos están colonizados con E. coli que alberga la isla pks.

Fig. 2 E. coli (pks+) genera aductos de DNA potencialmente mutagénicos implicados en la

carcinogénesis, (Adaptado de Garrett 2019)

La colibactina forma enlaces cruzados entre cadenas de ADN mediante la alquilación de fracciones de adenina en cadenas de ADN opuestas. Induce el desarrollo lítico en ciertas bacterias que contienen profagos.

 Un trabajo publicado recientemente respalda el papel cancerígeno de Escherichia coli que lleva la isla de patogenicidad de policétido sintasa (pks) que codifica enzimas para la biosíntesis de colibactina. La asociación de la dieta de estilo occidental (rica en carne roja y procesada) con la incidencia de cáncer colorrectal podría ser más fuerte para los tumores que contienen cantidades más altas de pks + E. coli.

Fig. 3. Maridaje entre cáncer de colon y la tabla de embutidos.

La OMS considera carne procesada cualquier tipo de carne que ha sido transformada con salazón, curado, fermentación, ahumado u otros procesos para mejorar el sabor y preservar el alimento. Esto incluiría beicon,  salchichas, hamburguesas y también embutidos. Aunque la mayoría de ellos son de carne de vaca o cerdo, este grupo también incluye embutidos hechos con sangre, carne picada de ave o vísceras.

Bibliografía

Garrett, Wendy S. 2019. «The gut microbiota and colon cancer». Science 364 (6446): 1133-36.https://doi.org/10.1126/science.aaw2367.

Arthur JC (2020). "Microbiota and colorectal cancer: colibactin makes its mark". Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 17 (6): 317–318. doi:10.1038/s41575-020-0303-y. PMID 32317778. S2CID 216033220.

 Zhou T, Hirayama Y, Watanabe K (2021). "Isolation of New Colibactin Metabolites from Wild-Type Escherichia coli and In Situ Trapping of a Mature Colibactin Derivative". Journal of the American Chemical Society. 143 (14): 5526–5533. doi:10.1021/jacs.1c01495. PMID 33787233.

 Helmink BA, Khan M, Wargo JA (2019). "The microbiome, cancer, and cancer therapy". Nature Medicine. 25 (3): 377–388. doi:10.1038/s41591-019-0377-7. PMID 30842679. S2CID 71145949.

 Wernke KM, Xue M, Herzon SB (2020). "Structure and bioactivity of colibactin". Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 30 (15): 127280. doi:10.1016/j.bmcl.2020.127280. PMC 7309967. PMID 32527463.

 Balskus EP (2015). "Colibactin: understanding an elusive gut bacterial genotoxin". Natural Product Reports. 32 (11): 1534–40. doi:10.1039/c5np00091b. PMID 26390983.

 Silpe, Justin E.; Wong, Joel W. H.; Owen, Siân V.; Baym, Michael; Balskus, Emily P. (2022-02-23). "The bacterial toxin colibactin triggers prophage induction". Nature: 1–6. doi:10.1038/s41586-022-04444-3. ISSN 1476-4687. PMID 35197633.

Bacteriaje

El bacteriaje (el aterrizaje en una bacteria) por parte de los fagos tiene un problema asociado: ¿Cómo hacer con la presión interna de la eubacteria?

Es inspirador comprobar como los ingenieros del programa Apollo se tuvieron que enfrentar a un problema similar y por este motivo muestro este video:

Apollo Docking sequence - Connecting the Command Module to the Lunar Module.

Bacteriófagos inmunes a las enzimas de restricción gracias a la 2-aminoadenina

 dos equipos de investigación han demostrado que bacteriófagos incluyen en su genoma una nucleobase llamada 2–aminoadenina (con abreviatura Z) en lugar de adenina. Es lo que se conoce como una base nitrogenada análoga.

GENOMA RESISTENTE: La nucleobase «Z» que remplaza la «A» en el alfabeto genético de determinados virus forma tres puentes de hidrógeno en vez de dos, lo que dificulta la separación de las dos hebras del ADN. Fuente

El artículo de la bióloga computacional Suwen Zhao y su equipo de la Universidad de ShanghaiTech, han descrito la síntesis del ADN con Z por el bacteriófago. Paralelamente, otro equipo de investigadores franceses publicó en la misma revista un par de artículos que llegaban a conclusiones similares.

Fue en la década de 1970, cuando un grupo de científicos de la antigua Unión Soviética descubrieron el ADN con Z en un virus bacteriófago denominado S-2L, que infecta a las bacterias fotosintéticas. Se dieron cuenta que el ADN del virus se comportaba de una forma extraña cuando sus dos hebras helicoidales se disociaban con el calor. Lo habitual es que necesitase más temperatura para romper la unión entre las nucleobases C y G que para romper la unión entre A y T, pero el ADN del virus se comportaba como si sólo contuviera parejas de C y G. Otros análisis demostraron que había sustituido las A por Z, para unirse éstas con más intensidad a las T. Posteriormente, se ha demostrado que esta modificación en el genoma de S-2L evitaba que las enzimas de restricción de las bacterias, que detruyen el ADN del bacteriófago, pudiesen degradar el ADN de S-2L.

El trabajo de los dos equipos demostró que el virus estudiado tenía un gen denominado PurZ, que codificaba una enzima muy importante para las primeras etapas de la síntesis del nucleótido Z. Esta enzima se producía a partir de una molécula presente en las células bacterianas.El paso siguiente fue completar la vía metabólica gracias a otras enzimas encontradas en el genoma de las bacterias infectadas.

¿Cómo puede la polimerasa trabajar con un análogo de base nitrogenada?

El equipo francés investigó el virus bacteriófago de Vibrio y observó que tiene un gen junto a PurZ que codifica una enzima denominada polimerasa. Su misión era copiar el ADN y hallaron que incorpora el dZTP en el ADN a la vez que retira las nucleobases del tipo A presentes. Por su parte, el equipo de Zhao sostiene que es necesario encontrar otra enzima, encargada de degradar el dATP intracelular a la vez que conserva el dZTP.

Todavía queda mucho por conocer, pero estos trabajos abren la puerta evitar bacterias resistentes a los bacteriófagos. Un paso más hacia la utilización de bacteriófagos como alternativas a los antibióticos.

Fagos como alternativa a los antibióticos

 El río Ganges transcurre por una de las regiones más densamente pobladas del planeta. Por ese motivo, a sus aguas llegan todos los días trillones de bacterias intestinales procedentes de los 12 metros de intestinos de millones de personas. Por ese motivo, en el Ganges además de muchísimas bacterias intestinales existe un número todavía más impresionante de virus come bacterias, los llamados bacteriófagos (fago significa comer en griego), también llamados fagos. 

Ernest Hankin, bacteriólogo que descubrió la presencia de los fagos, pionero aeronáutico y un montón de cosas más. Fuente

En 1896, un médico inglés, Ernest Hankin describió que las aguas de este río y del río Jumna, también en la India, poseían propiedades antibacterianas (Salmond and Finneran, 2015) especialmente contra la bacteria causante del cólera. 

En 2015 Twort y en 1917 D´Herelle descubrieron el mundo de los virus que "devoraban" bacterias, los fagos. Y comenzó la carrera por eliminar las bacterias infecciosas (Abedon et al, 2011). 

En la década de 1920, antes del desarrollo de los antibióticos varios médicos comenzaron a tratar infecciones con fagos. Estos virus atacan específicamente a las bacterias sin ser capaces de penetrar en las células de mamíferos o de plantas. Compañías farmacéuticas como Eli Lilly & Co llegaron a comercializarlos (Sulakvelidze et al, 2001). Con la llegada de la penicilina, este tipo de tratamientos basados en fagos se vieron desplazados en Occidente por un producto que eliminaba todo tipo de bacterias sin necesidad de caracterizar la bacteria responsable de la infección. Sin embargo las terapias basadas en fagos continuaron en la extinta Unión Soviética y países satélites. Durante 60 años científicos de estos países publicaron sus resultados en revistas en ruso, polaco y georgiano. En estos países los fagos se utilizaron administrados oralmente en pastillas y líquidos, tópicamente, rectalmente y en inyecciones durante 90 sin que se registrasen reseñas de efectos secundarios.

Aunque existe en la República de Georgia un instituto médico que ofrece estas terapias a sus pacientes, www.eliava-institute.org y en la Unión Europea está en marcha un ensayo clínico para emplear fagos contra Clostridium, el empleo de fagos en humanos en Occidente es escaso. Hay dos motivos para ello, por una parte las agencias americana (FDA) y europea del medicamento (EMA) tienen como máxima un medicamento un principio activo. Los fagos se suelen administrar en cocktails de varios fagos para evitar la aparición de resistencias. Otra razón es que las industrias farmacéuticas no están interesadas en productos en los que puedan aparecer resistencias antes de que venza su patente. 

El uso de terapias basadas en fagos está más avanzada en el ámbito ganadero, primero por tener una regulación más laxa y segundo por el aumento de la demanda de carne libre de antibióticos. La compañía Intralytix tiene dos productos aprobados por la FDA: ListShieldTM y EcoShieldTM, y un tercero SalmoFreshTM pendiente de aprobación. Investigadores independientes de la USDA en Beltsville, Maryland demostraron que EcoShield redujo la concentración de Escherichia coli O157:H7  100 veces en un solo día (Abuladze et al, 2008). 

Fagos como alternativa a los antibióticos

La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha declarado en abril de 2014 que la humanidad ha entrado en la era postantibiótica, un periodo en el que la medicina no estará segura al 100% de la eficacia de los antibióticos. Necesitamos urgentemente alternativas a los antibióticos. Una de las causas más importantes en la aparición de resistencias a los antibióticos ha sido su abuso en ganadería, como suplemento alimenticio para prevenir la aparición de enfermedades. El consumo de antibióticos en ganadería es casi cuatro veces más grande que su consumo para uso humano.

Los antibióticos, a pesar de su abuso, en humanos sólo se recetan en respuesta a una enfermedad. En las granjas sin embargo, los antibióticos se utilizan de rutina para promover el crecimiento animal y para prevenir la aparición de brotes infecciosos. Esta práctica ha transformado el microbioma de estos animales de granjas convirtiendo a sus bacterias comensales en reservorios de genes de resistencia a los antibióticos (Baquero, Alvarez-Ortega, & Martinez, 2009). Estas bacterias llegan a la comunidad a través de los trabajadores de las granjas y a través de productos de alimentación (Martinez, 2009).

Las iniciativas llevadas a cabo por distintos gobiernos para limitar su uso en granjas no han tenido demasiado éxito (Roesch et al., 2006). Este problema unido al hecho de que muchos consumidores reclaman productos libres de antibióticos es lo que ha animado a distintas compañías a desarrollar productos basados en fagos para el uso en granjas (Gill & Hyman, 2010).

El descubrimiento de nuevos antibióticos está limitado por el escaso número de moléculas esenciales bacterianas que son lo suficientemente distintas de las humanas para ser buenas dianas terapéuticas (Kohanski, Dwyer, & Collins, 2010). Ser conscientes de este problema mientras todos los días vemos nuevos casos de bacterias multirresistentes a los antibióticos ha dado alas a la investigación en bacteriófagos. Por las especiales características de los fagos no podemos esperar de ellos lo que tenemos con los antibióticos (Gill & Hyman, 2010). Lo mejor es pensar en los fagos no como malos antibióticos sino desde las potencialidades que presentan: especificidad, capacidad de replicación, facilidad de obtención (Levin & Bull, 1996).  Los fagos nos permitirán matar una bacteria patógena dejando la flora bacteriana intacta, podremos descontaminar pozos de agua con pequeñas cantidades de fagos, producirlos en países del tercer mundo con un coste reducido (Marks & Sharp, 2000) o como en el caso de este proyecto generar cócteles a la carta contra bacterias patogénicas aisladas en el Ecuador.

Ventajas de usar fagos

Primero: son unidades autoreplicativas; se replican solamente en el lugar de la infección que es donde se ubican las bacterias patógenas, con lo que se garantiza una máxima dosis de agente antibacteriano en el lugar donde se necesita

Segundo: son más específicos que los antibióticos y por tanto no causan, o lo hacen en mucho menor escala, daño a la microbiota normal del huésped

Tercero: producen pocos efectos secundarios; son una buena alternativa para pacientes alérgicos a antibióticos

Cuarto: los costes de producción son bajos

Quinto: pueden utilizarse con fines profilácticos

Sexto: se pueden suministrar por rutas muy diferentes

Séptimo: poseen efectos sinérgicos con los antibióticos convencionales 

Octavo: la búsqueda de bacteriófagos nuevos es algo rápido y económico, por supuesto mucho más que la de nuevos antibióticos

Nueve: los fagos codifican millones de proteínas con actividad antibacteriana: los enzibióticos

El término enzibiótico es la suma de la palabra enzima y antibiótico. Inicialmente se utilizó exclusivamente para incluir enzimas codificados por bacteriófagos que mostraban actividad antibacteriana.  Hoy se ha ampliado para toda clase de enzimas que independientemente de su origen presentan actividad antibacteriana y/o antifúngica e incluso antiviral. 

Endolisinas: hidrolizan los enlaces covalentes del peptidoglucano para favorecer la liberación de la progenie viral

Las lisinas o endolisinas están codificadas principalmente por bacteriófagos con DNA bicatenario e hidrolizan los enlaces covalentes del peptidoglucano para favorecer la liberación de la progenie viral que por cientos o miles se produce en cualquier ciclo lítico productivo (Young et al., 2000). El término “endolisina” fue introducido en la literatura científica por Jacob y Fuerst en 1958 para hacer hincapié en las lisinas que actuaban desde dentro de la célula y según esto los enzibióticos al actuar desde fuera deberían ser denominados simplemente como “lisinas”. La ruptura del esqueleto carbonado del péptidoglucano da lugar a su acción antibacteriana. Dependiendo de las especificidades enzimáticas las lisinas caen en cinco grandes grupos: N-acetilmuramoil L-alanina amidasa, endopeptidasas, N-acetil muramidasas (lisozimas), endo-β-N-acetil glucosaminidasas y finalmente las transglicosilasas.

Tipos de enzibióticos disponibles anti bacterias Gram positivas

Además, algunas lisinas pueden afectar al crecimiento bacteriano porque poseen secuencias que por su capacidad amfipática desestabilizan la membrana bacteriana (estas secuencias se han detectado en las lisinas del fago T4 que afecta a enterobacterias y los fagos D3 y φKZ de Pseudomonas aeruginosa). De hecho, en una serie de elegantes experimentos (Düring et al., 1999) demuestran que este aspecto es incluso más importante que la lisis del peptidoglucano, pues puede facilitar en el caso de las bacterias Gram negativas el acceso de la lisina a la capa de peptidoglucano, al interactuar creando microporos en la membrana externa (Orito et al., 2004).

Holinas: provocan pequeños agujeros por donde puede salir del citoplasma la lisina del fago

Las holinas (del inglés “hole” agujero) son proteínas codificadas por el genoma de los bacteriófagos para que al interaccionar con la membrana bacteriana realicen pequeños agujeros por donde puede salir la lisina del virus y degradar la capa de peptidoglucano, para que finalmente pueda ser liberada toda la progenie viral. Este sistema de dos componentes (holina/lisina) está sobre todo presente en bacteriófagos complejos de DNA bicatenario como material genético. Otros virus bacterianos más sencillos que incluyen a los DNA y RNA monocatenarios carecen de esta sofisticación e inducen la lisis de la bacteria interfiriendo con la síntesis del peptidoglucano.

Tipos de holinas 

Las bacterias y los fagos, en la naturaleza, se encuentran formando biofilms

Desde la época de Koch, se ha investigado a las bacterias y microorganismos principalmente en su forma planctónica, es decir, en medio líquido. Sin embargo,  aunque se ha postulado que el 99% de las bacterias en un ecosistema existen como biopelículas o biofilms, la investigación de microorganismos formadores de biofilms puede considerarse un área nueva debido a la complejidad de estas muestras. Los fagos, se encuentran allí donde están las células en las que se replican. Si la mayoría de las bacterias existen en biofilms, los fagos también están en ellos. 

Las bacterias se encuentran, en un 2-5% de la masa del biofilm, embebidas en una matriz extracelular,

compuesta por una mezcla de compuestos poliméricos como polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos,

y lípidos. El biofilm tiene canales para distribuir agua, nutrientes, oxígeno, enzimas y desechos celulares. Los fagos se mueven y se difunden por estos canales. 

Los biofilms son un problema en la industria alimenticia

En la industria de productos frescos, bacterias como Salmonella, E. coli O157: H7, L. monocytogenes, Shigella, Bacillus cereus, Clostridium perfringens y Yersinia ingresan a las instalaciones de procesamiento adheridas a los tejidos vegetales donde pueden crecer formando biopelículas (Beuchat , 2002; Da Silva Felicio et al., 2015).

Salmonella spp. y Campylobacter spp. son los patógenos más comunes que se encuentran en las industrias avícolas. La adhesión de Salmonella está influenciada por diferentes propiedades fisicoquímicas de las superficies; por ejemplo, Salmonella puede crecer a 16 ° C en acero inoxidable, mientras que la adherencia se ve obstaculizada en el vidrio (De Oliveira et al., 2014).

Una correlación entre la persistencia de Salmonella spp. en la industria de procesamiento de pescado y también se informó sobre la capacidad para la formación de biopelículas (Vestby et al., 2009).

Algunos fagos, provistos de exopolisacáridos despolimerasas, pueden degradar el material polimérico extracelular, facilitando así la entrada de fagos en las capas más profundas de las biopelículas con la posterior lisis de las bacterias diana (Parasion et al., 2014). Otras proteínas codificadas por fagos con actividad polisacárido despolimerasa se pueden utilizar como agentes antibiofilm (Cornelissen et al., 2011; Gutiérrez et al., 2012b, 2015a).

Además, los bacteriófagos pueden diseñarse para expresar proteínas destinadas a mejorar sus propiedades anti-biofilm. Por ejemplo, el fago T7 se diseñó genéticamente para incorporar el gen dspB que codifica una polisacárido despolimerasa de Actinobacillus actinomycetemcomitans, que fue más eficaz para reducir el recuento bacteriano en las biopelículas de E. coli (Lu y Collins, 2007).

Los biofilms formados por S. enterica serovar Typhimurium se trataron con endolisina Lys68 (2 µM), y esto edujo en 1 unidad logarítmica las células viables en las biopelículas preformadas después de 2 h de incubación en presencia de permeabilizadores de la membrana externa (Oliveira et al., 2014) .

 Recientemente se han descrito dos nuevas endolisinas termoestables, Lys68 del fago phi68 de Salmonella (Oliveira et al., 2014) y Ph2119 del bacteriófago Ph2119 que infecta la cepa MAT2119 de Thermus scotoductus (Plotka et al., 2014). Esta termoestabilidad respalda el uso potencial de estas enzimas derivadas de fagos como desinfectantes.

Bibliografía

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Phage-therapy-and-bacteriophages-conference-in-june-2022-in-riga

Purificación del ADN del fago lambda mediante Purelink

 1.    El primer paso es añadir 2 ml del buffer EQ1 en las columnas para que tengan el ambiente iónico adecuado para unir el ADN. Se le da un spin en la centrífuga para que baje el buffer.

Buffer EQ1     0.1 M Acetato sódico pH 5.0 

                                    0.6 M NaCl 

                                    0.15% (v/v) Triton® X-100

2.    Obtenemos los lisados de las bacterias y los fagos que se encuentran en ellos lavando con PBS una placa Petri o si de un cultivo líquido. Determinamos con una pipeta el volume exacto.

3.    Dependiendo del volumen que tengamos del lisado añadimos un volumen de buffer X1 que va entre 30 µL de buffer X1 a 10 mL. Incubamos a 37º C durante 30 min para darle tiempo a la RNasa A y a la DNasa I a degradar el ARN y el ADN respectivamente. El EDTA de este buffer capta los iones metálicos y de esa forma inactiva las metaloproteinasas que podrían estar degradando la cápside proteica de los fagos. 

        Buffer X1 =     100 mM Tris-HCl (pH 7.5)

                                    300 mM NaCl

                                    10 mM EDTA

                                    20 mg/mL RNasa A, 

                                    6 mg/mL DNasa I

4.    Al tubo con la digestion de las nucleasas añadimos 2 mL de buffer X2 a 4ºC e incubo en hielo durante una hora. La alta concentración de sal y el PEG ayudan a condensar los ácidos nucleicos, además, junto con el frio inactivan a las DNasas y RNasas.

        Buffer X2 =     3 M NaCl

                                    30% (w/v) polietileneglicol (PEG) 6000

5.     Para recolectar a los fagos intactos, centrifugamos durante 10 minutes a velocidad máxima (más de 10,000 x g). Desechamos el sobrenadante que contiene los restos de lípidos, proteínas, ADN y ARN de las bacterias lisadas.

6.    Resuspendemos el pellet con los fagos en 1 ml de buffer X3 con una pipeta. El EDTA impide la degradación de metaloproteinasas. El tris mantiene un pH fisiológico

        Buffer X3 =     100 mM Tris-HCl (pH 8.0)

                                    25 mM EDTA

7.    Añadimos 1 mL de buffer X4 a la suspensión de fagos. Mezclamos concienzudamente invirtiendo el tubo varias veces e incubando por 10 min a 70 ºC para disgregar la cápside proteica y liberar los ácidos nucleicos de los fagos.

        Buffer X4 =     4% (w/v) SDS

8.    Añadimos 1 mL de buffer X5 al tubo con los fagos lisados. Mezclamos concienzudamente invirtiendo el tupo y centrifugamos durante10 minutes a temperatura ambiente y 13,000 x g. Los ácidos nucleicos del fago habrán condensado por la acción del acetato potásico 3M, mientras que los restos proteicos de los fagos, o los fagos que todavía están intactos se van a ir al pellet. Tomamos el sobrenadante evitando el pellet y lo aplicamos sobre las columnas que han sido previamente equilibradas en el paso 1. Dejamos que el lisado penetre en la resina de la columna por gravedad. Los ácidos nucleicos se quedarán pegados a la resina

        Buffer X5 =     3.0 M acetato potásico (ajustar el pH 5.5 con ácido acético)

9.    Lavamos la columna para descartar todo aquello que no sean los ácidos  nucleicos adheridos a la matriz de la columna. Lavamos 2 x 2.5 mL con el buffer W8 (Wash Buffer).

Buffer W8 =     0.1 M Acetato sódico (pH 5.0 ajustado con ácido acético)

        (wash buffer)       825 mM NaCl

10.    Eluímos el ADN del fago mediante 0.9 mL de buffer X6. Es el alto contenido en NaCl la que hace que el ADN ya no se adhiera a la matriz de la columna. A este volume se le añade 630 ul de of isopropanol (0.7 del volume previo) a temperatura ambiente. Este paso hace que el ADN se deshidrate y se compacte.

        Buffer X6 =     0.1 M acetato sódico (a pH 5.0 ajustado con ácido acético)

                                    1,5 M NaCl

11.    Centrifugamos el ADN a máxima velocidad 13,000 x g a 4 ºC durante 30 min. Como el ADN de los fagos es pegajoso se pueden fijar a la pared del tubo de centrífuga si el rotor es de ángulo fijo. Por eso es mejor un rotor basculane tipo (i.e. HB-4 or HB-6 para centrífugas Sorval). Como alternativa se pueden usar tubos Corex siliconizados con dimetildiclorosilano.

12. Después de la centrifugación se lava el pellet de ADN con 80% de etanol (así se eliminan sales) y se seca al aire. El ADN se resuspende en agua, TE o 10 mM Tris buffer (pH 8.0).