Fagos: lo que no hace el uno lo hace el otro

Los fagos se pueden utilizar como terapia antibacteriana. El fago introduce su ADN en la bacteria. Este ADN empieza a hacer copias de si mismo y posteriormente las proteínas que les hace falta. Las proteínas se ensamblan con el ADN dentro y en ese momento las múltiples copias del fago revientan a la bacteria por dentro y salen al exterior en busca de nuevas bacterias. Fuente

Las bacterias se defienden de los bacteriófagos (virus especializados en eubacterias) cortando el ADN de estos virus cuando entran en la célula. Para ello utilizan o bien enzimas de restricción, que cortan todo el ADN que no está metilado (el de las bacterias está metilado), o bien mediante el sistema CRISPR, el cual le permite a la bacteria cortar ADN similar al que alguna vez le infectó a ella o a sus progenitores.

En dos artículos publicados recientemente (ver referencias) dos grupos independientes han observado la estrategia altruista que realizan los fagos para evitar las defensas de las bacterias.

Las bacterias producen una proteína anti CRISPR-Cas que la inactiva. La proteína se llama Acr (anti-CRISPR). Los fagos que presentan los genes para producir esta proteína se llaman fagos-Acr. Aunque las bacterias pueden resistir las proteínas Acrs, su respuesta se ve muy disminuída. Así, los fagos tienen alguna oportunidad de resistir, multiplicarse y lisar la bacteria para procurar nuevas células.

En esta fotografía de microscopía electrónica se observa al fago introduciendo el ADN en el interior de la bacteria. Fuente

Esto podría ser de utilidad para los científicos que trabajan con los fagos como alternativa a los antibióticos. Si los fagos que se utilicen en la terapia antibacteriana son portadores de genes acr entonces las dosis de fagos utilizadas en la terapia pueden ser mucho menores.

Hoy por ti, mañana por mi

Los fagos cooperan en su invasión a la bacteria de manera altruista. El primer fago bloquea CRISPR-Cas con Acr y el segundo fago tiene la oportunidad de replicar De esta manera, en una infección por fagos hay que tener en cuenta si alguno de ellos porta genes acr.
 Referencias: 

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)30721-9 
 https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)30738-4

https://www.eurekalert.org/pub_releases/2018-07/uoe-vct071818.php

CRISPR y sus inconvenientes

El objetivo de estas preguntas es que reflexioneis sobre lo que supone editar ADN. Los dos inconvenientes principales de CRISPR-Cas son que, la ínfima probabilidad cometer errores que tiene el sistema al final ocurra al tener que repetir el proceso millones de veces en el caso de organismos adultos y también el hecho de que las proteínas Cas son bacterianas y por tanto pueden ser detectadas por el sistema inmune y disparar una respuesta inflamatoria. Os dejo de cada pregunta dos respuestas, una larga y otra corta, que os pueden orientar de cuales eran las soluciones correctas y que fueron puntuadas con 10. Las respuestas sin sentido no fueron evaluadas.

¿Es posible que el sistema CRISPR-Cas causase mutaciones en otras partes del genoma y los investigadores no pudiesen detectarlas?

 Si es posible que causen otras mutaciones. En varios genes pueden existir secuencias homólogas de bases similares a la secuencia a editar. Es así que el ARN podría asociarse a estos sitios y la proteína Cas genere cortes u ediciones no deseadas. En otro caso, la proteína Cas9 puede cortar el ADN sin la presencia de ARN, de esta forma crear mutaciones no detectadas por los científicos. 

 

¿Cuáles son las ventajas de tratar de editar mutaciones en un embrión comparado con tratar las mutaciones en un adulto?

 

Ya que el embrión posee pocas células resulta más sencillo aplicar la técnica de CRISPR-Cas, pues es menor la cantidad de células a modificar a diferencia del adulto en el cual su desarrollo celular está completo. En diferentes investigaciones se ha observado que en el embrión no es necesario usar varias veces la técnica CRISPR ni la proteína Cas debido a que el embrión utiliza la copia correcta del gen para corregir la mutación evitando así la creación de mutaciones en otros genes con secuencias homologas. Sin embargo, el uso de la técnica CRIPR-Cas es un tema en conflicto puesto que éticamente al usar esta técnica en embriones se busca mantener un papel de alguien supremo que puede llegar a crear y modificar a un ser humano (En esta respuesta no se hizo mención a que en el embrión no existe un sistema inmune y esa es otra ventaja de editar ADN en sistemas tan sencillos)

Si se utilizase el sistema CRISPR-Cas en adultos con cáncer y algunas de las células se muriesen y liberasen la proteína Cas al torrente sanguíneo ¿Podría haber una reacción inmunológica contra esa proteína?

Si, debido a que las células del sistema inmunológico existentes en el torrente sanguíneo poseen anticuerpos que reconocen elementos extraños al cuerpo humano; por lo tanto se reconoce a la proteína Cas como un componente foráneo generando así una respuesta inmune. Además, una vez que se ha utilizado la proteína de origen bacteriano por primera vez el cuerpo humano genera una serie de anticuerpos para dar resistencia a esta proteína.

Las bacterias tienen también dos sistemas inmunológicos

Los animales superiores tenemos dos sistemas inmunológicos: el innato y el adquirido. El innato es un sistema que, cuando detecta moléculas que existen de forma genérica en las bacterias o en virus pero que no existen en nosotros. Cuando una bacteria o un virus entran en nuestro organismo el sistema innato se pone en marcha para erradicarlos. El sistema inmune adquirido o adaptativo es el que está mediado por anticuerpos. Es una respuesta específica contra todo aquello que no estaban previamente en nuestro cuerpo: protozoos, bacterias, virus y cualquier molécula que este sistema no reconozca como propia. Es una respuesta inmunitaria que produce memoria inmunológica que te protege después de haber estado en contacto con el elemento extraño. Es la memoria inmunológica que activan las vacunas.

Las bacterias también tienen dos sistemas inmunológicos, innato, es decir, genérico y adaptativo, o específico. Como las bacterias son organismos unicelulares, su sistema inmunológico es intracelular. Además su tamaño tan pequeño hace que sólo se tengan que preocupar de no ser invadidas por organismos más pequeños que ellas, como los virus o los plásmidos.

Los plásmidos son como pequeños cromosomas de ADN circular. Tienen la capacidad de producir una especie de pene de proteína para pasar de una bacteria a otra. Obviamente, todo en biología es más rico y más complejo, pero en este momento estoy haciendo una descripción de brocha gorda.

Detalle al microscopio electrónico de un pili conjugativo, que no es otra cosa que un pene de proteína, que se establece entre dos bacterias. Los plásmidos utilizan estos penes para pasar de una bacteria a otra.

Los virus de bacterias, llamados bacteriófagos, es decir comedores de bacterias y a los que,  a partir de ahora, les llamaremos fagos, son distintos a los virus humanos. Los virus humanos entran dentro de la célula humana y allí se desnudan y su ADN o ARN, depende de la clase de virus se copia muchas veces hasta que se encapsidan de nuevo listos para romper la célula e infectar otras. Los fagos inyectan su ADN o ARN dentro de la bacteria porque las bacterias están a presión y no podrían engullir al virus como hacen las células humanas. Por ese motivo, los fagos tienen una forma distinta, una forma que recuerda a una mezcla de mosquito y bomba de hinchar las ruedas de la bicicleta.

Como lo único que entra en la bacteria es ADN o ARN es por eso que sus sistema inmune está especializado en destruir ácidos nucleicos extraños. El sistema inmune innato de bacterias son las enzimas de restricción y el sistema inmune adaptativo es el sistema CRISPR-Cas

Una tijera de ADN para eliminarlos a todos

Las enzimas de restricción son proteínas que cortan ADN. Las bacterias las producen para evitar ser colonizadas por fagos o por plásmidos. Las enzimas cortan ADN de la siguiente forma:

Las enzimas de restricción se nombran con tres letras que recuerdan la bacteria donde fue caracterizada, seguidas a veces por una letra más, que identifica el serotipo y finalmente por un número romano que las  identifica en caso de que en una bacteria se hayan encontrado varias enzimas con distintas dianas. Cada enzima de restricción reconoce una secuencia de ADN determinada, la diana de la enzima. Una vez reconoce la diana cortará el ADN en las dos hebras de manera característica. Fuente

En el video se ve un plásmido, molécula de ADN circular. La enzima EcoRI la va a cortar y posteriormente aparecerá otro fragmento lineal de ADN que va a ser incorporado al plásmido porque ambos fragmentos han sido cortados con EcoRI y sus extremos son cohesivos, es decir, complementarios y mediante una segunda enzima, la ligasa, este fragmento se va a sellar con el plásmido. A esta técnica se le llama "Ingeniería genética". Los fragmentos de DNA producidos al ser digerida por EcoRI forman colas protuberantes de cadena sencilla (“extremos cohesivos”) que pueden formar puentes de hidrógeno con colas complementarias de cadena sencilla que fragmentos de DNA que provengan de cualquier otra fuente. Si se mezclan en las condiciones adecuadas, los fragmentos de DNA de dos fuentes diferentes forman moléculas recombinantes por la unión mediante puentes de hidrógeno de sus extremos cohesivos.  Los enlaces covalentes faltantes entre los extremos cohesivos de fragmentos reasociados se pueden “sellar” por la acción de las enzimas DNA ligasas, dando lugar a una molécula de DNA recombinante.

Un sistema que destruye ADN, siendo el ADN la molécula que guarda la información de la mayoría de virus y de todas las bacterias, debe reconocer el ADN propio del ADN foraneo. Para lograr distinguir lo propio de lo extraño, la bacteria tiene un sistema llamado metilación-restricción. Para cada enzima de restricción existe una metilasa, es decir, una enzima que añade grupos metilo (-CH3) a las bases nitrogenadas del ADN de la secuencia diana que corta la enzima de restricción. Al estar metilado las dianas de las enzimas de restricción del cromosoma bacteriano, éste no puede ser cortado por sus propias enzimas de restricción. Cuando los fagos o los plásmidos entran en la célula bacteriana, sus ADNs no están metilados y si llevan una secuencia diana para la enzima de restricción de la bacteria van a ser cortados por esta siendo así inutilizados.

 El nombre de enzimas de restricción alude al hecho de que restringen la posibilidad de infección por virus. Para cada enzima de restricción, una metilasa reconoce la misma secuencia que constituye el sitio de restricción y une covalentemente grupos metilo a determinadas bases del DNA en dicha secuencia. El mecanismo de defensa es el siguiente: el DNA propio de la bacteria es metilado de una forma específica, característica de cada especie bacteriana (en las secuencias reconocidas tanto por la restrictasa como por la metilasa de esa especie). La metilación de las bases impide la unión de la enzima de restricción, con lo que el DNA propio no es hidrolizado. Por el contrario, al entrar en la célula DNA de otro organismo, no metilado o con un patrón de metilación diferente, este DNA puede ser degradado por la enzima de restricción, ya que carece de los grupos metilo en la secuencia diana

 CRISPR-Cas o cuando la tijera se vuelve específica

El sistema adquirido en bacterias es el sistema CRIPR-Cas, descubierto por Francis Mójica y que recientemente ha sido reconocido por Doubda y Charpentier como un método para editar ADN.

Podíamos amplificar el número de copias de un gen gracias a la técnica de la PCR y su enzima TagPolimerasa, podíamos cortar ADN con las enzimas de restricción pegar los pedazos con la ligasa. Ahora las proteínas Cas nos permiten reescribir el ADN y correguir fallos. Ya tenenemos en nuestras manos las posibilidades de un buen editor de texto: copia, corta, pega y edita.

El blog de Curiosidades de la microbiología explica maravillosamente esta técnica revolucionaria, así que os animo a que hagáis clic en el enlace. Lo único que Manuel Sánchez no aclara suficientemente en la entrada de su blog, es cómo el sistema CRISPR-Cas hace para no cortar su propio ADN. Pues bien, para que la proteína Cas corte el ADN, el ADN invasor tiene que tener una secuencia PAM (motivo adyacente al protoespaciador, en sus siglas en inglés) colindante a su fragmento de crARN procesado

Sistema CRISPR-Cas. Fuente

Sistema CRISPR-Cas. La proteína Cas (en azul) se une al ADN que es reconocido por el crARN procesado que lleva en su interior (en violeta) y lo corta. El ADN cortado puede incorporar un ADN sintético (en verde claro) que corrija el trozo de ADN que se cortó. Lo importante para que la proteína Cas no corte el fragmento de ADN vírico que sirve de molde para producir el crARN procesado es que ese crARN procesado no lleva la secuencia PAM que si lleva el ADN del virus original. En caso de que queramos que el crARN sea sintético y sirva para localizar una secuencia de genes humanos, de pez o de bacteria tenemos que tener en cuenta que esa secuencia tiene que estar al lado de una PAM para que así Cas pueda cortar. Las secuencias PAM más habituales suelen ser  5'-NGA-3 ' o  5'-NGG-3 ', en donde N puede ser cualquier nucleótido.Fuente

Video en inglés que explica el mecanismo CRISPR-Cas

                                    Video en inglés que explica el mecanismo CRISPR-Cas subtitulado al castellano

 Esta técnica ya está dando sus primeros frutos en embriones humanos. Aunque, como técnica que es, siempre es susceptible de mejoras.

PARA SABER MÁS:

Los sistemas inmunológicos de sistemas: un cuento que parece no acabar.

Un interruptor para CRISPR

Un "Interruptor" para el sistema de edición de genes crispr cas9 que se ha llevado a la ciencia y la tecnología por la tormenta en el último decenio Parece que sí. Un nuevo estudio de la universidad de California - san francisco describe la identificación de las proteínas anti-Crispr creadas por virus bacteriana.
" como la tecnología crispr se desarrolló de los sistemas de defensa anti-virales naturales en bacterias, también podemos aprovechar las proteínas anti-Crispr que los virus han esculpido para obtener alrededor de esas defensas bacterianas."

https://www.eurekalert.org/pub_releases/2016-12/uoc--ofc122616.php?utm_content=buffer057b0&utm_medium=social&utm_source=facebook.com&utm_campaign=buffer

Guía para entender CRISPR

http://curiosidadesdelamicrobiologia.blogspot.com.es/2014/05/la-revolucion-crisprcas.html

Como toda técnica, CRISPR no está exento de problemas que habrá que ir solucionando en el futuro:

https://elpais.com/elpais/2018/01/09/ciencia/1515515273_743583.html

Un descubrimiento que podría cambiar las habilidades, características y el futuro de la humanidad: CRISPR-Cas9 modificación genética

Autores: Steve Muñoz, Victor Velastegui, José Andres Romero, Ana Herrera, alumnos de Medicina de la UDLA, Quito (Entrada pendiente de revisión)

INTRODUCCION: En la antigüedad los médicos solo curaban enfermedades y finalmente en el año 2003 se llegó a leer por primera vez un genoma humano, sin poder escribirlo. Hoy en día, la técnica CRISPR-Cas nos permite escribir genes. ¿Podemos realmente modificar el genoma humano y revolucionar el mundo?

PARTE UNO: Actualmente es posible avanzar lo estudios en esta técnica para lograr a futuro modificar un genoma humano para así poder prevenir a las futuras generaciones de ciertas enfermedades o anticiparlas. Debido al constante estudio de esta técnica CRISPR-Cas9 se ha hecho posible lo que años atrás parecía inviable que es la escritura de un genoma, sin embargo, lo que se quiere lograr con todos los avances tecnológicos, es el fácil acceso de este nuevo método a todas las personas que deseen usarlo. Una vez que sea posible modificar el genoma humano se pretender tenerlo al alcance de todos y no únicamente de las personas de altas posibilidades, por lo que es necesario el constante estudio por parte de los investigadores para lograr hacerlo lo más simple posible y así pueda ser obtenido por el mayor número de usuarios.

PARTE DOS: Se han realizado varias pruebas sobre el modelo CRIPSR-Cas en ratones, debido a que no existen características que diferencien a un embrión humano al de un embrión de ratón. La prueba consistía en inyectar la proteína Cas-9 en una vena de un ratón sometido a la prueba, logrando así que se sustituyera el segmento de mutación por la secuencia propia o correcta del gen afectado. Sin embargo, la practica funciono únicamente en 1 de cada 250 células del área afectada, que debido a la concentración de una enzima especifica ¨fumarilacetoacetato¨ mataban a las células que ocasionaban la mutación, mientras que las sanas se iban intercambiado y en un lapso de 30 días, aproximadamente un tercio de las células afectadas ya funcionaban correctamente y el roedor puesto a prueba lograba vivir sin necesidad de un tratamiento específico.

A pesar de todas las pruebas de la herramienta CRISPR-Cas que se han realizado en animales, la técnica no resulta lo necesariamente segura ni 100% fiable para poder ser movida de estos modelos en animales a un nuevo modelo en un ser humano. Ya que en las pruebas de animales, muchas veces se producen efectos secundarios como en los ratones, se produjeron alteraciones en la pigmentación de la piel.

PARTE 3 BENEFICIOS DE CRISPR-Cas9

Este procedimiento podría estar cerca la cura o prevención de varias enfermedades de una persona incluso de sus generaciones. (FUNDACION MENCIA DREAMS COME TRUE, 2015)

Debido a que consiste en modificar la línea germinal, es decir la CRISPR-Cas9 puede modificar el ADN de un óvulo, espermatozoide o embrión, de esta manera será más fácil modificar lo inherente al ser humano y además transmitirlo de generación en generación.

Se ha logrado la obtención de proteínas de seres vivos: hormonas como insulina, de crecimiento, factores de coagulación, etc. , se clonan los genes de ciertas proteínas humanas en microorganismos adecuados para su fabricación, como la producción de insulina obtenida a través de la levadura Sacharomyces Cerevisae, donde se clona el gen de la insulina en humanos. (PROYECTO GENOMA HUMANO, 2009)

Obtención de anticuerpos monoclonales, ha sido importante para luchar contra enfermedades como el cáncer, incluso su diagnóstico antes de que aparezcan los primeros síntomas, como ejemplo el interferón, utilizado como complementario a la quimioterapia.

En el caso de la visión, se podría editar las cédulas de la retina para recuperar la visión.

Se puede insertar genes humanos responsables de la producción de insulina en células bacterianas para que obtener insulina de gran calidad a bajo coste. Estas células pueden producir mucha cantidad ya que se reproducen a una gran velocidad

Extracción de células madre de un embrión de ratón genéticamente modificado. (ANNE-CHRISTINE POUJOULAT AFP)

Parte 4

PROCESO DE ACTIVACION

La enzima Cas9 la cual es una proteína que es capaz de romper un enlace en la cadena de los ácidos nucleicos se usa para llevar a cabo el proceso que activara ciertos genes humanos específicos, llevando factores sintéticos de transcripción.

El proceso comienza por el diseño de una molécula de ARN la cual puede ser CRISPR, esta después se insertara en una célula específica. Esta ya estando dentro reconocerá el sitio exacto del genoma donde esta enzima Cas9 deberá cortar.

Entonces de esta forma se activara el respectivo proceso para modificar genéticamente a los futuros habitantes de este planeta.

LEGALIDAD Y ETICA

Hasta la fecha no se ha identificado ningún inconveniente legal a momento de la práctica de este proceso, eso sí, hay una cierta responsabilidad al momento de usar la misma, ya que este tipo de modificaciones conllevan una práctica con procesos adecuados y profesionales, y de esto dependerá el resultado que se de a la hora de haberlo realizado y de esto dependerá el tipo de cargos que se apliquen a las personas que practiquen esta técnica.

En cuanto al ámbito ético, este proceso va en contra de leyes naturales preestablecidas por la naturaleza y por la vida en si, dicho esto hay ciertas personas que están en contra de este proceso por las mismas razones mencionadas y no aprueba el hecho de que la nueva sociedad de estos tiempos, este jugando a ser dios con todo este procedimiento.

PARTE 5

¿Cómo se descubrió la técnica de crisp-cas?

En los primeros años de la década de los 90, el científico Francisco Mojica de la universidad de Alicante, pudo hallar las secuencias repetidas en una arquea, que posteriormente serian identificadas como CRISPR. Y los datos obtenidos durante la investigación fueron sacados a la luz en el año de 1933

El científico Francisco Mojica y su grupo de investigadores se percataron que las secuencias CRISPR y los espaciadores relacionados posiblemente formaban parte de cierto tipo de sistema inmune característico de las bacterias. Posteriormente analizaron un sistema CRISPR, el cual era más sencillo y estaba basado en una proteína cuyo nombre es CAS9 el cual se encargar de cortar la molécula de ARN en pedazos los cuales son llamados ARNcr

¿Efectos secundarios de la técnica Crisp-Cas9

Uno de los efectos secundarios de la técnica de crisp-cas9 y esta es posiblemente la reacción en cadena genética, el cual consiste en aumentar las modificaciones genéticas no solo en las células de un solo organismo sino en todos los organismos dentro de una población, el proceso no pararía nunca y es bastante útil al punto de propagarse muy rápidamente en toda la comunidad en pocas generaciones

CIERRE

En la Universidad de las Américas UDLA, como nuestro principal objetivo es aprender a leer y escribir la Medicina tradicional, queremos también aprender a leer la genética, con lo cual en un futuro muy próximo logremos escribir y modificar genes para aprovechar de mejor manera los beneficios de la Medicina, al poder recuperar órganos importantes como el corazón, cerebro, pulmones. Sería importante si podríamos tener la capacidad de modificar los genes de un embrión y optimizar su sistema inmunológico, podría ser también la capacidad de adquirir fácilmente musculatura, algo muy necesario en nuestro medio como son las ventajas intelectuales y muchas cosas más que nos permitan desenvolvernos de mejor manera en nuestro medio.

BIBLIOGRAFIA:

• Curiosidades de la microbiología, La revolución de Crisp/cas, (2016) recuperado el 16/4/2016 de http://curiosidadesdelamicrobiologia.blogspot.com/2014/05/la-revolucion-crisprcas.html
• Wikipedia, CRISPR, (2016), recuperado el 16/4/2016 de https://es.wikipedia.org/wiki/CRISPR
• El País, Los peligros de la edición genómica, (2016), recuperado el 16/4/2016 de http://elpais.com/elpais/2015/08/07/ciencia/1438958647_795056.html
• Fundación Mencía Dreams come true, 2015, El corta y pega genético, hito científico de 2015 según la Revista Science, tomado de: www.fundacionmencia.org/es
• Proyecto Genoma Humano, 2019, Ventajas y Desventajas de la Ingeniería Genética, tomado de: www.jpd-beker.blogspot.com
• El Mundo, 2015, Manipular el ADN para erradicar enfermedades hereditarias, tomado de: www.elmundo.es/salud/2015