Cómo evalular la actividad antibacteriana de aceites esenciales

Piper aduncum. Los aceites esenciales de determinadas plantas son una fuente de compuestos con actividades antimicrobianas. 

1. Evaluación de actividad antibacteriana (MIC) por microdilución

Inóculo bacteriano

Aceite esencial a evaluar

Placa de microdilución

Resazurina (indicador colorimétrico)

Estufa a 37 °C

Micropipetas

Medio BHI

Preparación

Precalienta la estufa a 37 °C (como si fuera el horno).

Añade 100 μL del inóculo en cada pocillo de la placa (como servir la base).

Agrega 100 μL del aceite esencial en cada columna, ajustando las concentraciones finales entre 512 y 0.5 μg/mL.

Repite todo por triplicado.

Incuba la placa a 37 °C durante 24 horas.

Pasado ese tiempo, añade 20 μL de resazurina a cada pocillo.

Espera 1 hora.

Observa el color: aquí determinas la CIM (MIC) por inspección visual.

Ensayo de modulación de actividad antibiótica

Amikacina

Gentamicina

Aceite esencial (a concentración subinhibitoria: MIC/8)

Suspensión bacteriana

Medio BHI al 10%

Tubos de ensayo

Placa de microdilución

Preparación

En un tubo, mezcla:

150 μL de suspensión bacteriana

Solución con 10% de BHI

Aceite esencial a MIC/8  

Prepara un tubo control igual, pero sin aceite esencial.

Toma 100 μL de cada mezcla y pásalos a los pocillos correspondientes de la placa. 

En el primer pocillo de cada fila, añade 100 μL del antibiótico (amikacina o gentamicina).

Realiza diluciones seriadas del antibiótico a lo largo de la fila. Haz todo por triplicado.

Incuba y determina la CIM igual que en la receta anterior.

2. Método de evaluación de MICs de aceites esenciales por difusión en disco

1. Objetivo

Evaluar la actividad antibacteriana de un aceite esencial mediante el método de difusión en disco y determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC) en microorganismos sensibles.

2. Materiales y reactivos

Aceite esencial a evaluar

Discos de papel estériles (5 mm)

Caldo BHI (Brain Heart Infusion)

Caldo Mueller–Hinton (Britaina® Ref B0213705)

Agar TSA (Tryptic Soy Agar, Sigma Aldrich)

Tween 20 (0,1% v/v)

Solución salina estéril al 0,85%

Estándar McFarland N.º 0.5

DMSO (dimetilsulfóxido)

Antibióticos de referencia:

Oxacilin® BBLTM (1 µg)

Vancomicyn® Himedia (30 µg)

Cefuroxime® Oxoid (30 µg)

Aztreonam® Oxoid (30 µg)

Imipenem® BBLTM (10 µg)

Placas de Petri estériles

Micropipetas y puntas estériles

Incubadora a 37 °C

3. Preparación del inóculo bacteriano

Mantener las cepas en caldo BHI a temperatura ambiente.

Transferir 2,5 mL del cultivo a caldo Mueller–Hinton.

Incubar a 37 °C durante 18 h.

Diluir el cultivo en solución salina estéril al 0,85% hasta obtener una turbidez equivalente al estándar McFarland 0.5 (≈ 1 × 10⁶–10⁸ UFC/mL).

4. Siembra en placas

Preparar placas con agar TSA + Tween 20 al 0,1% v/v.

Extender uniformemente el inóculo sobre la superficie de cada placa usando un hisopo estéril.

5. Preparación de los discos con aceite esencial

Colocar discos de papel estériles (5 mm) sobre la superficie de las placas inoculadas.

Pipetear 5–10 μL del aceite esencial puro sobre cada disco.

Dejar reposar las placas 30 min a temperatura ambiente para permitir la difusión inicial.

6. Incubación

Incubar las placas a 37 °C durante 24 h.

7. Lectura del halo de inhibición

Medir el diámetro del halo de inhibición alrededor de cada disco.

Expresar los resultados en milímetros (mm).

Incluir controles positivos con antibióticos de referencia para validar la sensibilidad de las cepas.

8. Determinación de la MIC

Solo para microorganismos que presentaron halos de inhibición.

Preparar diluciones del aceite esencial en DMSO dentro del rango 5–10 μg/mL.

Aplicar 10 μL de cada dilución sobre discos de papel estériles.

Colocar los discos sobre placas inoculadas con la bacteria correspondiente.

Incubar a 37 °C durante 24 h.

Definir la MIC como la concentración más baja que inhibe el crecimiento bacteriano visible.

Incluir un control negativo con discos impregnados solo con DMSO.

9. Repetibilidad

Repetir todos los experimentos tres veces para asegurar reproducibilidad.

10. Referencia: 

Este protocolo sigue una metodología similar a la descrita en estudios previos realizados con otras especies vegetales: Rojas, J., Buitrago-Díaz, A., Ramírez, H., & Fernández-Moreira, E., 2025. Chemical composition and antibacterial activity of essential oil from Baccharis nitida (Ruiz & Pav.) Pers. (Asteraceae). leaves collected in Mérida-Venezuela. J Essent Oil-Bear Plants. 28(2), 340-351. https://doi.org/10.1080/0972060X.2025.247655¿

¿Qué es mejor microdilución o difusión en disco?

Para Para publicación seria / comparar MIC con otros autores → microdilución.

Para Para cribado inicial / mostrar visualmente la actividad → discos y halos.

1. Método de difusión en disco (halos de inhibición)

Ventajas:
Muy sencillo: ideal para un primer cribado de múltiples aceites o fracciones.
Visual: los halos impresionan en fotos (docencia, posters, introducción de artículos).
Pocos recursos: discos, placas, pipeta y listo.
Problemas específicos con aceites esenciales:
Difusión irregular: los aceites son hidrofóbicos; difunden mal y de forma heterogénea en agar.
Un aceite muy activo puede dar halo pequeño solo porque difunde mal.
Difícil estandarización: el tamaño del halo depende de:
Volumen aplicado
Viscosidad del aceite
Solvente usado
Grosor del agar
No da una MIC verdadera: puedes decir “tiene actividad”, pero la concentración efectiva en el frente del halo es desconocida.

Bueno para: “¿Mi aceite hace algo contra esta bacteria?”
Malo para: “¿Cuál es la MIC exacta? ¿Puedo compararla con otros estudios?”

2. Método de microdilución (en caldo, con o sin resazurina)

Ventajas claras:
Entrega una MIC definida:
Sabes la concentración exacta que inhibe el crecimiento (ej. 64 μg/mL).
Permite comparar entre estudios y compuestos:
Puedes decir “este aceite es más potente que tal antibiótico/otro aceite”.
Se adapta bien a aceites esenciales:
Usas un solvente/emulsionante (DMSO, Tween, etc.) para dispersar el aceite.
El contacto aceite–bacteria es más homogéneo que en agar.
Permite hacer también MBC (inoculando en placas desde los pocillos).
Desventajas:
Más trabajo técnico: preparación de diluciones seriadas, controles, lectura (turbidez, resazurina, etc.).
Necesitas cuidar bien el efecto del solvente (ver controles con DMSO/Tween).
Requiere más tiempo de diseño experimental.
Ideal para: estudios serios de eficacia, tablas de MIC, comparación entre especies de Piper, benchmarking frente a antibióticos.
Menos vistoso, pero mucho más sólido científicamente.