No hay dos sin tres: el papel de los fagos en la interacción bacteria-célula eucariota

La bacteriología dio un paso de gigante gracias a una investigadora, Fanny Hesse (22 de junio de 1850-1 de diciembre de 1934), que ayudó a su marido, un investigador que trabajaba en el laboratorio del pionero de la microbiología médica Robert Koch. La aportación de Fanny Hesse consistió en mezclar carne de carne con un gelificante que se extrae de algas, el agar agar. Fanny, que era de Nueva York, sabía del agar-agar por unos vecinos que había tenido que habían vivido en Java y en esa isla, sus habitantes, utilizaban el agar-agar como gelificante para sus jaleas y para espesar caldos. El marido de Fanny había intentado obtener cultivos sólidos para bacterias con gelatina extraída de huesos de vaca. El problema de la gelatina es que las bacterias producían enzimas que la degradaban tranformándola placa en un líquido turbio. Además, en verano, con el calor, la gelatina se licuaba. El agar agar se licuaba a partir de una temperatura más alta, 50°C.

Cultivo bacteriano en placa Petri. Divulgación científica (IQOG-CSIC)

Cultivos sólidos de bacterias ¡Un paso de gigante en la microbiología!

Al tener placas sólidas de caldo de carne se podían crecer las bacterias en un medio en dos dimensiones. ¿Por qué supuso este descubrimiento un paso de gigante? Porque se podían, en este medio, rascar una muestra de bacterias de manera que se pudiese aislar una única bacteria. ¿Cómo sabemos esto? porque si obtenemos una colonia separada de las demás bacterias al día siguiente de rascar la muestra en esta placa de medio sólido, esto quiere decir que esa colonia procede de una única bacteria. De esta manera tan elegante se aíslan bacterias en los laboratorios de hoy en día, 140 años después del descubrimiento de Fanny Hesse.

Trabajar con cultivos puros, provenientes de una única bacteria, se ha convertido en un estandar en los laboratorios de microbiología. Esto es así porque en ciencia siempre se tiende a reducir variables. Si trabajamos con cultivos en los que puede haber distintas células, sin que estemos seguros de qué células se trata, entonces no nos podemos fiar de las conclusiones de nuestro estudio. Siempre habría un colega que nos diría ¡Eso depende! y tendría razón, dependería de lo que hubiese allí metido.

Los biofilms se pueden visualizar con microscopía confocal, se pueden disgregar y crecer en medio líquido, en placas Petri. La mayor parte de las bacterias crecen en biofilms asociadas a algún sustrato.

Hoy en día, los microbiólogos estamos empezando a trabajar con varias especies al mismo tiempo. Utilizamos unos reactores patentados por el Center for Disease Control de Atlanta, en los EEUU, en donde unas pequeñas piezas redondas sirven para que se forme una película, como las bacterias que crecen en las paredes de piscinas cuando están sucias, o en los bordes de nuestras bañeras, y en esa película (biofilm) pueden crecer otras especies. De esta manera empezamos a trabajar con cultivos controlados de dos especies, en un ambiente más tridimensional. Pero ya sabemos que no hay dos sin tres:

Los fagos son esenciales para la interacción bacteria-hospedador

Estudiando el microbioma de esponjas de la costa norte española, los investigadores se encontraron con un viroma impresionante. Al analizar este viroma encontraron que en los bacteriófagos (virus que atacan a las bacterias) contenían secuencias genéticas de repeticiones de ankirina.

Las ankirinas son proteínas que ayudan a las bacterias patogénicas o comensales para infectar y manipular a sus hospedadores eucarióticos. 

Las células de las esponjas y las de sus bacterias endosimbióticas son difíciles de cultivar. Así que probar el papel de la ankirina en la asociación de bacterias endosimbióticas y las esponjas es una tarea muy ingrata. En esos casos, los biólogos utilizan especies conocidas ¡Y a correr!. Obviamente, las conclusiones luego se extrapolan. Extrarpolar, para los lectores de memes y los estudiantes españoles de la Logse, es cuando se espera que lo que valga para unas especies valga para las otras, aunque como os podéis imaginar a veces esto no sucede así.

En las esponjas marinas que albergan bacterias endosimbióticas se han encontrado una panoplia de bacteriófagos (A).  Los experimentos in vitro revelaron que una proteína producida por un subconjunto de los virus transmitidos por esponjas, conocidos como ankifagos, parece ayudar a suprimir las respuestas inmunes en los macrófagos murinos cuando es absorbida y exhibida, o expresada y secretada por E. coli (B). Las células del sistema inmune destruyeron menos bacterias con la proteína ankirina comparado con bacterias que no expresaban esta proteína. Estos resultado sugieren que los ankifagos pueden facilitar la cohabitación de bacterias comensales con sus hospedadores eucariotas.  Fuente

Los fagos reducen la respuesta inflamatoria

Para probar el papel de la ankirina, lo que se hizo fue expresar la ankirina en Escherichia coli y dársela de comer a macrófagos de ratones. Lo que vieron los investigadores fue que los macrófagos comían menos E. coli con ankirina que sin ankirina.  Además se observó que cuando E. coli secretaba ankirina al medio los macrófagos dejaban de secretar sustancias que activaban la respuesta inflamatoria.

Los ankifagos introducen su genoma en la bacteria. En el genoma del ankifago contiene un gen para la producción de la proteína ankirina. Esta proteína reduce la respuesta proinflamatoria reduciendo NF-kB, Tnfa, Cxcl1, Ifnb, Il1b. Esto favorece la coexistencia de bacterias y macrófagos de ratón (arriba). En las bacterias que no expresan ankirina (abajo) son engullidas y destruídas por los macrófagos. Fuente

Ankirina por todas partes

Los investigadores buscaron en las bases de datos genómicas por otros especies en grupos distantes. Encontraron pruebas de que existía ankirina en otros microbiomas, incluidos microbiomas humanos. Este descubrimiento subraya la importancia que tienen los fagos en una relación a tres entre célula eucariota-bacteria-fago.

Estudiar bacterias aisladas no es entender qué es una bacteria

El estudiar bacterias aisladas en colonias ha permitido muchísimos avances. Sin embargo, la dimensión social de las bacterias ha sido más complicada de entender utilizando cultivos puros. Richard Lenski comenzó un experimento a partir de una colonia de E. coli. Separó este cultivo en seis y los dejó evolucionar en placas Petri durante años. Observó que con el tiempo y completamente al azar, estas seis colonias divergían genéticamente en el tiempo. De esta manera demostró que no existe un cultivo puro en el tiempo. Greg Velicer y otros investigadores del comportamiento social de las bacterias comprobaron que las bacterias Myxococcus xantus, también a partir de cultivos puros, cuando están sometidas a hambruna son capaces de diferenciarse en un cuerpo vegetativo que se eleva de la placa en donde crecen para formar unas esporas que tienen como objetivo diseminarse. Con esto quiero decir que en principio los cultivos, aunque sean puros y clonales pueden cambiar en el tiempo y dependiendo de las condiciones de alimentos. Si además, añadimos espacialidad y la presencia de otras especies todo se complica enormemente.

Si nosotros quisiésemos estudiar chimpancés tendríamos que ir a África. Poco podríamos entender sobre ellos estudiando chimpancés viviendo solos en una jaula de barrotes. Fuente

Crecer bacterias solas en cultivos sólidos en placas Petri no es fácil. Solo una minoría de bacterias crece en estas condiciones. Lograr cultivar una bacteria en placa Petri abre la posibilidad de investigar esa bacteria. Sin embargo, son bacterias aisladas, lo mismo que un chimpancé, un animal social, igual que las bacterias, viviendo aislado solito en una jaula.

Para crecer Legionella pneumophila hace falta añadir carbón activo. La función del carbón activo es capturar alguna sustancia que existe en el agar agar y que impide el crecimiento de Legionella. Si no le añadimos carbón activo Legionella no crece, pero si crecería una bacteria más generalista como E. coli. Hay una manera de crecer Legionella sin añadir carbón activo: si lavamos varias veces el agar agar y posteriormente lo secamos antes de utilizarlo para hacer las placas de Legionella, con el agar lavado Legionella puede crecer en las placas Petri.

Las bacterias tienen que crear interacciones con bacterias de su misma especie y otras, normalmente en biofilms. Tienen que crear territorios, fronteras. Estas son las limitaciones de trabajar con cultivos puros de bacterias.

Para saber más:
The scientist
https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(19)30428-7