Protocolo de diagnóstico de COVID mediante ELISA

Antígeno recombinante de la espícula S1 (RBD) para COVID-19 (SARSCoV-2). Fuente

Los coronavirus son virus envueltos que poseen glicoproteínas (S) de pico trimérico grandes requeridas para el reconocimiento de los receptores del huésped para muchos coronavirus, así como para la fusión de las membranas virales y de las células huésped para la entrada del virus en las células. Durante la salida viral de las células huésped infectadas, algunas proteínas del coronavirus S se dividen en subunidades S1 y S2. La subunidad S1 es responsable de la unión huésped-receptor, mientras que la subunidad S2 contiene la maquinaria de fusión de membranas. Por tanto, la subunidad S1 contiene el dominio de unión al receptor (RBD), ubicado en la región C-terminal. Este dominio se utiliza como biomarcador para el diagnóstico de COVID.

Protocolo de ELISA indirecto IgG anti-SARS-CoV-2

1. Sensibilizar (día anterior) una placa Inmunolon de 96 pocillos con 50ul/pocillo de 2.5 µg/ml de proteína recombinante (antígeno) RBD en buffer fosfato salina (PBS1X) - ponemos 4987,5 µl de PBS 
1X y 12,5 µl de RBD, durante toda la noche a temperatura ambiente en cama húmeda.

PREPARACIÓN BÚFERES
Buffer de Lavado: Preparar 1 litro. 900 ml de agua destilada estéril + 100 ml de PBS 10X + 1 ml tween.
Preparar 200 ml de PBS 1X: 180 ml de agua destilada estéril + 20 ml de PBS 10X
Buffer de Bloqueo: 12 ml PBS 1X + 0.48 g BSA + 12 µl Tween.
Buffer de dilución: 100 ml PBS 1X + 100 µl Tween + 5 g leche

PROGRAMA DE LAVADOS

Hacer un lavado con 60 µl antes de iniciar el proceso.

Luego de cada lavado realizar lavados con 10 µl.

El terminar, hacer dos lavados con 60 µl. y posteriormente con agua destilada estéril y luego en seco.

Video ELISA para detección de Sars-Cov2 (Covid 19). 

2. Desechar la solución de antígeno no fijada y lavar la placa UNA vez con 270 µl por pocillo con            PBS-T (Programa 1 Lavador de ELISAS).

3. Bloquear la placa con 100 µl/pocillo con Buffer de bloqueo, durante 30 minutos a 37°C. 

4. Desechar la solución de bloqueo y lavar la placa 5 veces con 270 µl por pocillo de PBS-T                        (Programa 2 Lavador de ELISAS).

5. En un tubo eppendorf colocar 495 µl de buffer de dilución y 5 µl de muestra (incluir control                     negativo, positivo y pool´s), homogenizar por 2 minutos.

6. Añadir 100 µl de cada tubo eppendorf (respectivamente) en la placa.

7. Incubar a 37°C durante 1 hora (Si se pasa un poco el tiempo, no importa… mucho, pero EVITAR         que se quede seca la placa).

8. Lavar las placas 5 veces con 270 µl por pocillo de PBS-T (Programa 3 Lavador de ELISAS).

PREPARACIÓN DE BUFER

Buffer de conjugado: Colocar 10000 µl de buffer de dilución y 1,25 µl de goat anti IgG humana-HRP

9. Adicionar 100 µl de conjugado por pocillo e incubar a 37°C durante 30minutos.

Min 8:22 Adición del anticuerpo conjugado

10. Lavar las placas 7 veces con 270 µl por pocillo de PBS-T (Programa 4 Lavador de ELISAS).

PREPARACIÓN Sustrato OPD

En 10 ml de agua ultrapura, disolver la MITAD de la pastilla DORADA y antes de utilizar el sustrato añadir la MITAD de la pastilla PLATEADA. PROTEGER DE LA LUZ.

Min 11:23 Preparación sustrato OPD para visualizar la fluorescencia

11. Añadir 100 µl por pocillo de Sustrato OPD preparado fresco.

12. Incubar 10 minutos en la oscuridad.

13. Detener la reacción con 100 µl por pocillo de ácido clorhídrico 3N.

14. Leer las placas en un lector de ELISA a 490 nm.

        1. Entrar al programa Gen 3.08

        2. Standard

        3. Placa 11

        4. Protocol

        5. Plate Layout (ordenar)

        6. Verificar a 490 nm

        7. Read new

        8. Cálculos de ELISA