Secuenciación de amplicones CleanPlex para ADN y ARN-Seq

Tecnología de secuenciación de amplicones CleanPlex para ADN y ARN-Seq

https://www.paragongenomics.com/targeted-sequencing/amplicon-sequencing/cleanplex-ngs-amplicon-sequencing/

Criterios para decidir que muestras a analizar:

No deben de ser familiares, el Ct debe ser menor de 28. Tienen que ser mayores de edad. Debemos saber cual es su domicilio

El valor Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ARN en la muestra. Por tanto, un valor alto significa que hacen más ciclos de amplificación de la PCR para poder tener una cantidad apreciable de ARN amplificado. Fuente

RNA quantification (Qbit4). Debemos partir de un mínimo de 5 ngr

Al laboratorio nos llegan las placas de 96 pocillos con el ARN de los pacientes. Hay que descongelarlas. Este ARN es el que se utiliza en los laboratorios clínicos para las RTPCRs de las personas a las que se quiere saber si son positivas para Sars-CoV-2. No se secuencian todas las muestras

Aquí las placas vienen con un punto que corresponde a las muestras que nos interesan: provenientes de mayores de edad, de los cuáles sabemos donde viven, que su ct sea <28. Esto se hace para tener muestras lo más distintas posibles entre si para que nos muestren una "radiografía" los más precisa de la composición clonal del Sars-CoV-2 en el Ecuador. Una vez tomamos la muestra las volvemos a congelar. Los volúmes de muestra que tomamos van a depender de la concentración de muestra que tengamos. Para ello, debemos debemos cuantificar por duplicado en el Qubit4. Una vez sabemos cuál es la concentración de nuestras muestras las diluimos para que la concentración de ARN sea un valor entre 50 y 60 ngr de ARN. 

Para cada secuenciación tomamos 24 muestras que es lo que soporta el secuenciador.

1A RT-Reaction (90 min)

Ahora tenemos agua, muestra y primers. Homogenizamos con un shaker 5 seg a 1600 rpm

Le damos un spin para bajar la muestra y la metemos en la máquina de RT-PCR con el siguiente programa: 

Cuando hagamos el mix debemos recordar que tenemos que x25 porqué tenemos 24 muestras

Las pipetas las debemos de limpiar de RNasas con: 

1B Post-RT-purification

2A Multiplex PCR reaction

2B Post-mPCR purification

3A Digestion reaction

3B Post Digestion purification

4A Second PCR reaction

4B Post-second PCR purification

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