miércoles, 11 de agosto de 2021

Clonación in silico del gen gyrA de Streptococcus pneumoniae

Vamos a clonar el gen gyrA de S. pneumoniae. Este fue el primer gen que secuencié

Para de la clonación por simulación utilizaremos cuatro herramientas bioinformáticas:

NEBcutter: Es un programa online de la empresa New England Biolabs que comercializa más de 250 enzimas de restricción distintas. Nos permite simular digestión enzimática de moléculas lineales o circulares de ADN.

SerialCloner: Este es una aplicación de biología molecular que permite leer y escribir ficheros en fasta.
Sus herramientas permiten el análisis y visualización de secuencias de ADN, así como la clonación y expresión genética. Dispone de mapas genéticos, mapas de secuencias, visores de fragmentos de ADN. Debemos descargarnos esta app en nuestro computador.

Expasy:
 Programa online del Instituto Suizo de Bioinformática que permite analizar secuencias y estructuras de proteínas. Para nuestro ejercicio introduciremos el plásmido con el gen clonado para averiguar si el ORF está en marco de lectura

Blastp: el ORF localizado por Expasy se puede alinear con otras secuencias de proteínas similares lo que nos dirá de qué proteína se trata

1 Realice una búsqueda en el NCBI del gen que desea clonar y emplee la secuencia del gen en el SerialCloner. Dentro de esta secuencia identifique cual es la secuencia codificadora de la proteína (CDS) (“FIND” y “ORF” pueden ser de ayuda para ello). Una vez encontrada la secuencia, genere otro archivo y guárdelo con el formato (.gb). Genere el mapa de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína que ha elegido y considere los sitios de enzimas de restricción presentes en esta región.
2 Realice una búsqueda en el NCBI o en la página del proveedor de la secuencia de nucleótidos del plásmido a emplear para la clonación y emplee esta secuencia en el SerialCloner. Guarde esta secuencia en su computadora o USB. Genere un mapa con los sitios de enzimas de restricción y sitios relevantes para expresión que va a emplear para construir su plásmido recombinante.

3 Realizar la PCR: Continúe con la creación de primers para emplear en la futura reacción de PCR.
Forward primer: Puede seleccionar unas bases de inicio de la secuencia de nucleótidos codificadora de la proteína (CDS) y copiar y con ellas crear su primer adicionando bases adicionales al inicio del primer y la secuencia de enzima de restricción.
Forward Primer (FP)= 5’ Extra bases + Enzima de restricción + Secuencia idéntica al CDS 3’ 
Reverse Primer (RV)= 5’ Extra bases + Enzima de restricción + Secuencia reversa y complementaria al CDS 3’

Las bases extras se colocan para mantener el Open Reading Frame adecuado para la producción de la proteína y además dar estabilidad para la complementariedad del primer. La secuencia que contenga la enzima de restricción es la que se pretende emplear para la digestión del plásmido.

Para realizar el PCR, abra una ventana en el programa SerialCloner desde la barra superior del software opción de “PCR”; una ventana emergerá donde se colocarán los primers. En:
“Oligo tail not identical to the target sequence” → extra bases y enzima de restricción
“Segment identical to the target sequence” → FP Secuencia idéntica de inicio del CDS, RP Secuencia reversa y complementaria del final del CDS

Otra alternativa para crear los primers sin la secuencia de enzima de restricción es usar de la Barra de herramientas “Edit” y “Use as PCR Reverse Primer” o “Use as PCR Forward Primer” 
En la “Opción Select the target Sequence” seleccione la secuencia de CDS (guardado en el paso 2) y corra la PCR. Una nueva ventana emergerá con el producto del PCR, guarde este archivo.

4 De la barra de herramientas seleccione “Construct”. En la ventana que emerge seleccione en “Fragment 1” cargue el archivo del plásmido (guardado en el paso 3). Encuentre las enzimas a emplearse para digestión y de un click en la enzima de restricción del extremo 5’ del PCR y doble click en la enzima de restricción del extremo 3’ del PCR. En la sección “Fragment 2” cargue el archivo guardado en el paso 4 (producto de PCR). Encuentre las enzimas a emplearse para digestión y de un click en la enzima de restricción del extremo 5’ del PCR y doble click en la enzima de restricción del extremo 3’ del PCR. Y pulse “Ligate”

5    Vamos con un caso práctico: En una práctica previa hemos amplificado el gen gyrA de Streptococcus pneumoniae de manera que el fragmento amplificado está ahora flanqueado por dos dianas para enzimas de restricción: 

BamHI GGATCC

XbaI TCTAGA


Nos asegurarnos que estas dianas son únicas, es decir, que solo van a estar presentes en los extremos del fragmento de PCR que amplificó nuestro gen de interés y que en el vector de clonación están solo en copia única. ¿Cómo podemos saberlo? Introducimos el archivo fasta de nuestro gen en NEBcutter y entre las opciones del programa podemos ver las secuencias de las enzimas que van a cortar nuestro fragmento y también qué enzimas no van a tener dianas en el gen a clonar. Debemos ver también que las enzimas que vamos a utilizar para clonar no deben de estar en nuestro vector: pcDNA3.1(+). Haz clic para obtener su secuencia en formato fasta.

Se abre un documento nuevo en  el programa SerialCloner 2.6. Se pega la secuencia de la gyrA. Se salva el documento con un formato compatible (.xdna). Se hace lo mismo con la secuencia del vector. Seguidamente se procede a hacer la construcción del plásmido recombinante. Para eso, se debe dar clic en el icono Construct. Se abre una ventana donde aparecen tres subventanas: fragment #1 vector fragment; fragment #2; fragment #3.

En la ventana de fragment #1 seleccionaremos la secuencia del vector. En la del fragment #2 seleccionaremos la secuencia del fragmento de nuestro gen de interés. Presionas la opción ligate y observas en la ventana que aparece y observarás lo siguiente
así como en el Graphic Map que el resultado corresponde al vector digerido con las enzimas BamHI y XbaI ligado con el fragmento correspondiente al gen gyrA amplificado por PCR con las enzimas BamHI y XbaI y digerido con ambas enzimas. El resultado es un plásmido de 5640 pares de bases.

6    Si copiamos su secuencia, la del plásmido más el inserto y la introducimos en la función Translate de Expasy nos permite ver si el gen clonado tiene sentido cuando en la bacteria se exprese a proteínas
7    Puedes comprobar que esa proteína se corresponde con la proteína que querías clonar si haces un alineamiento con Blastp y compruebas que efectivamente esa secuencia corresponde al gen de interés.

Pero... ¿y si no obtienes un plásmido de 5640 pares? ¿Cuál es el error?

Quizás el error ha sido utilizar el fasta de gyrA pero no el fasta del gyrA amplificado por PCR al que se le ha adicionado las dianas para las enzimas de restricción BamHI y XbaI. Si utilizamos este fasta entonces tendremos éxito con la clonación ¿Puedes explicar por qué?

El plásmido PBLUESCRIPT ii sK (+/-) tiene un tamaño de 2961 nt pero después de la digestión con BamHI y XbaI queda linearizado y de un tamaño de 2955 nt:  tctagagcggccgccaccg /.../ cagcccgggggatcc

 ¿Puedes explicar por qué?

El fragmento amplificado del gen gyrA al que le hemos adicionado las dianas de restricción BamHI y XbaI así como 4 nt extra en cada extremo: GCGCGGATCCTTTTAAAAA /.../ CTGTCACTCTAGAGCGC mide 2705 nt, después de su digestión enzimática ¿Con cuántos nt quedaría?

Si después de realizar el ejercicio tienes un plásmido recombinante pBluescript II Sk + gyrA de 5640 nt ENHORABUENA. Y si no, sigue intentando :)

Rúbrica: 
REFERENCIAS:

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