En microbiología y parasitología el concepto de CMI es fundamental. Es un valor que nos ayuda a entender cuán activo es un compuesto contra la bacteria o el parásito que estamos tratando. Para hacer microdiluciones debemos primero de entender como hacer diluciones seriadas
Diluciones seriadasEn muchos casos se necesita preparar disoluciones con concentraciones extremadamente bajas de un soluto, hasta un punto que es difícil o imposible en la práctica medir la cantidad necesaria de producto sólido o el volumen de solución madre. En esas situaciones es necesario preparar una solución de mayor concentración (solución de stock o solución madre) y hacer diluciones sucesivas a partir de ésta hasta alcanzar la concentración deseada.
Para responder las preguntas de razonar, primero deberíamos repasar cómo argumentar para poder responder correctamente las preguntas
1 PREGUNTA: ¿Qué significa límite de linealidad en una curva de calibrado? ¿Qué significa límite detectable en un experimento de espectrofotometría?
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2 PREGUNTA: ¿Qué podemos hacer si la concentración de nuestra muestra excede el límite de linealidad?
3 PREGUNTA: En el cultivo de la izquierda tengo 1 ml de un cultivo de 64000 bacterias. ¿Cómo se harían las siguientes diluciones?:
PROBLEMA 4. Tengo un cultivo celular de una densidad óptica de 0.6. Sabemos que:
La concentración de bacterias en un cultivo = DO600nm x 1.2 109.
Por tanto, la concentración de bacterias será 0.6 x 1.2 109 = 7.2 109. Si tengo 7.2 109 bacterias por militro ¿Cuántas diluciones 1/10 tendría que hacer para tener un número en la placa que pudiese contar?
PROBLEMA 5. En un tubo Eppendorf tengo 1 ml de cultivo con 1x104 bacterias. He hecho un experimento de transformación con un plásmido. Por experimentos anteriores se que mi tasa de transformación es de 1 bacteria cada 10 millones de bacterias. Hago una dilución 1/1000 y siembro 10 ul de esa dilución. ¿Cuántas bacterias tendré en mi placa con antibiótico?
Solución: cero porque con solo 10.000 bacterias en el tubo y una tasa de transformación de 1 cada 10.000.000 lo más normal es no tener bacterias transformadas
PROBLEMA 6. En un tubo Eppendorf tengo 1 ml de cultivo con 1x1014 bacterias. He hecho un experimento de transformación con un plásmido. Por experimentos anteriores se que mi tasa de transformación es de 1 bacteria cada 10 millones de bacterias. Hago una dilución 1/1000 y siembro 10 ul de esa dilución. ¿Cuántas colonias tendré en mi placa con antibiótico?
Solución: 100 colonias
PROBLEMA 7. En un tubo Eppendorf tengo 1 ml de cultivo con 1x1014 bacterias. He hecho un experimento de transformación con un plásmido. Por experimentos anteriores se que mi tasa de transformación es de 1 bacteria cada 10 millones de bacterias. Hago una dilución 1/100 y seguidamente otra dilución 1/100 y siembro en una placa LB con antibiótico 100 ul de esa dilución. ¿Cuántas colonias tendré en mi placa con antibiótico?
Solución: 100 colonias
PROBLEMA 8. En un tubo Eppendorf tengo 1 ml de cultivo con 1x1014 bacterias. He hecho un experimento de transformación con un plásmido. Por experimentos anteriores se que mi tasa de transformación es de 1 bacteria cada 10 millones de bacterias. Hago una dilución 1/100 y seguidamente otra dilución 1/100 y siembro en una placa LB con antibiótico 100 ul de esa dilución. Me olvidé, porque soy humano, de poner antibiótico en las placas de LB ¿Cuántas colonias tendré ahora?
Solución: 1000 millones de colonias
Solución: cero porque con solo 10.000 bacterias en el tubo y una tasa de transformación de 1 cada 10.000.000 lo más normal es no tener bacterias transformadas
PROBLEMA 6. En un tubo Eppendorf tengo 1 ml de cultivo con 1x1014 bacterias. He hecho un experimento de transformación con un plásmido. Por experimentos anteriores se que mi tasa de transformación es de 1 bacteria cada 10 millones de bacterias. Hago una dilución 1/1000 y siembro 10 ul de esa dilución. ¿Cuántas colonias tendré en mi placa con antibiótico?
Solución: 100 colonias
PROBLEMA 7. En un tubo Eppendorf tengo 1 ml de cultivo con 1x1014 bacterias. He hecho un experimento de transformación con un plásmido. Por experimentos anteriores se que mi tasa de transformación es de 1 bacteria cada 10 millones de bacterias. Hago una dilución 1/100 y seguidamente otra dilución 1/100 y siembro en una placa LB con antibiótico 100 ul de esa dilución. ¿Cuántas colonias tendré en mi placa con antibiótico?
Solución: 100 colonias
PROBLEMA 8. En un tubo Eppendorf tengo 1 ml de cultivo con 1x1014 bacterias. He hecho un experimento de transformación con un plásmido. Por experimentos anteriores se que mi tasa de transformación es de 1 bacteria cada 10 millones de bacterias. Hago una dilución 1/100 y seguidamente otra dilución 1/100 y siembro en una placa LB con antibiótico 100 ul de esa dilución. Me olvidé, porque soy humano, de poner antibiótico en las placas de LB ¿Cuántas colonias tendré ahora?
Solución: 1000 millones de colonias
PROBLEMA 9. Tengo un stock de 50 mg/L del antibiótico ceftriaxona. Quiero probar la actividad de este compuesto con una bacteria para determinar cuál es la concentración mínima inhibitoria. Para ello tengo que hacer 8 diluciones seriadas medias para tener 50; 25; 12.5; 6.25; 3.125; 1.56, 0.78; 0.39 µg/ml Dibuja un diagrama mostrando cómo harías estas diluciones seriadas medias, teniendo en cuenta que el volumen final tiene que ser 100 µl.
PROBLEMA 10. Si queremos hacer una dilución 1/1000 de un producto en un volumen final de 1 ml. ¿Cómo puedo hacer? Haz un diagrama que ilustre como sería el proceso.
PROBLEMA 11. Tengo un cultivo bacteriano de 1.2 mil millones de bacterias. Quiero plaquear estas bacterias en placas Petri y tener un número aproximadamente de 60 colonias en una placa. ¿Cómo podría hacer? Utiliza la dilución seriada y haz un diagrama para visualizar cómo sería el proceso
PROBLEMA 12. Siembro en una
placa 5.8 x 108 células de Candida
albicans. Utilizo la técnica de siembra por agotamiento.
Imaginemos que cada vez que diluyo hago una dilución 1/10. ¿Cuántas veces tengo que repetir el proceso para tener un número de células que pueda contar? Como información podemos contar un número colonias entre 100 y 10
PROBLEMA 13 Dos antiparasitarios similares A y B tienen respectivamente una MIC de 16 y 2
antiparasitario A MIC = 16 ugr/ml
Aantiparasitario B MIC = 2 ugr/ml
¿Cuál sería el que recetarías y por qué?
Dado que los antiparasitarios suelen tener cierta toxicidad para el ser humano debido a que son agentes que atacan células eucariotas como las nuestras, para evitar la toxicidad de dos compuestos similares se debería recetar aquel que tenga una concentración mínima inhibitoria.
PROBLEMA 14 Dos antiparasitarios similares A y B tienen respectivamente una MIC de 8 y 2
antiparasitario A MIC = 8 ugr/ml
Aantiparasitario B MIC = 2 ugr/ml
¿Cuál de ellos recetarías primero y por qué?
Dado que los antiparasitarios suelen tener cierta toxicidad para el ser humano debido a que son agentes que atacan células eucariotas como las nuestras, para evitar la toxicidad de dos compuestos similares se debería recetar aquel que tenga una concentración mínima inhibitoria.
PROBLEMA 15 Tres antiparasitarios: metronidazol (MTZ), nitazoxanida (NTZ) y anfotericina B (AMB) tienen los siguientes MIC frente a una ameba
MTZ 2 ug/mL
NTZ 4 ug/mL
AMB 125 ug/mL
Respecto a su actividad antiparasitaria ¿Cuál sería más efectivo y por qué?
El metronidazol y la nitazoxanida son activos frenta a las amebas. La anfotericina tiene una MIC elevada por lo que deducimos que la ameba presenta cierto grado de resistencia a este fármaco. Dado que los antiparasitarios suelen tener cierta toxicidad para el ser humano debido a que son agentes que atacan células eucariotas como las nuestras, para evitar la toxicidad de dos compuestos similares se debería recetar aquel que tenga una concentración mínima inhibitoria.
PROBLEMA 16 ¿Por qué no puedo tratar una infección por hongos con un antibiótico?
Los hongos son organismos con células eucariotas similares a las de los humanos. Los antibióticos son compuestos que atacan moléculas que están presentes en las eubacterias y ausentes de las células eucariotas. Por ese motivo, lo antibióticos se utilizan para enfermedades bacterianas mientras que para enfermedades producidas por los hongos se utilizan los antifúngicos. Los antifúngicos atacan a las moléculas presentes en hongos y no en células humanas. Dado que hongos y humanos son más similares que bacterias y humanos hay menos antifúngicos en el mercado que antibióticos. También, por estas razones, suelen presentar una toxicidad a los humanos mayor que los antibióticos.
PROBLEMA 17 ¿Nombra tres características de los protozoos y dí en que se diferencian estas características de las bacterias?
Tamaño, presencia de núcleo, citoesqueleto, mayor tamaño ya que los protozoos proceden de una simbiosis de bacterias. Los protozoos carecen de peptidoglicano en su pared celular.
PROBLEMA 18 ¿Por qué si me bebo un vaso de agua en el que hay hierba no me enfermo a pesar de que haya millones de bacterias y protozoos?
Los microorganismos definen su capacidad infectiva, lo que está de alguna forma en relación con su capacidad patogénica con el concepto de dosis infectiva mínima. La dosis infecciosa mínima se define como el número mínimo de parásitos, bacterias o partículas virales que son capaces de infectar o causar una infección en el 50% de los individuos. La dosis mínima de los patógenos es exponencialmente más baja que los no patógenos. Por ejemplo, me puedo tomar un yogurt Toni con 1010 Lactobacillus y no me pasa nada, pero si bebo agua con 100 bacterias automáticamente desarrollo una enfermedad entérica.
PROBLEMA 19 Sois médicos rurales en una comunidad con un problema de parásitos. Os mandan dos tipos de parasitarios. Uno para amebas (metronidazol) y otro para nemátodos (ivermectina). Como los antiparasitarios tienen cierta toxicidad para el ser humano ¿Por qué tienen cierta toxicidad? Se suele administrar primero uno y al día siguiente el otro. ¿Cuál se administrará primero, el antiamebas o el antinemátodos y por qué?
No se administran los dos al mismo tiempo para no sumar los efectos secundarios que pudiera tener cada medicamento. Se toma primero uno, y al día siguiente otro. De esa manera, se le permite al riñón hacer su efecto detoxificador de la sangre. Se administra primero la ivermectina para matar a los nemátodos y luego el metronidazol. Si lo hacemos al contrario, los nemátodos pueden escaparse del cuerpo humano por garganta o ano causando alarma en la comunidad.
PROBLEMA 20 Se
utiliza un amebicida (un fármaco que destruye las amebas), metronidazol a
partir de un stock de 500 mg/L. Quiero probar la actividad de este compuesto
con una ameba recién descubierta para determinar cuál es la concentración
mínima inhibitoria. Para ello tengo que hacer 8 diluciones seriadas medias para
tener 50; 25; 12.5; 6.25; 3.125; 1.56, 0.78; 0.39 µg/ml Dibuja un diagrama
mostrando cómo harías estas disoluciones seriadas medias, teniendo en cuenta
que el volumen final tiene que ser 100 µl.
PROBLEMA 21 Tengo un cultivo de Candida albicans de 6 x 107 células por ml. Quiero plaquear estas levaduras en placas Petri y tener un número aproximadamente de 60 colonias en una placa. ¿Cómo podría hacer? Utiliza la dilución seriada y haz un diagrama para visualizar cómo sería el proceso
PROBLEMA 22 Si queremos hacer una dilución 1/1000000 de un producto en un volumen final de 1 ml debo de hacer diluciones seriadas 1/10. ¿Cómo puedo hacer? Haz un diagrama que ilustre como sería el proceso.
PROBLEMA 24 Tenemos dos parásitos similares. Solo difieren en su dosis letal. ¿Qué quiere decir que la dosis letal del parásito representado po LD50 rosa es mayor que la del parásito con una LD50 azul?
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