jueves, 28 de febrero de 2019

Práctica de transformación bacteriana


Materiales
Rotulador indeleble.
6 unidades
Asas metálicas de siembra
6 unidades
Guantes
30 pares
Juego de micropipetas (1-10 μl, 10-100 μl y 100-1000 μl)
6 juegos
Puntas para juego de micropipetas
6 racks por cada una
Tubos eppendorf de 1,5 ml.
10 unidades
Gradillas para tubos eppendorf
6 unidad

Reactivos
Agua destilada estéril para control negativo
50 ul

Plásmido pUC 18/19
6 ul

Placas Petri LB con ampicilina
20 ml
18 placas
Placa Petri LB sin ampicilina
20 ml
1 placa

Equipos
Baño María
1 unidad
Cámara de flujo laminar
1 unidad
Incubador 37°
1 unidad
Termoblock 42°
1 unidad

La transformación bacteriana es absorción directa, incorporación y expresión del material genético exógeno. Para ser mantenido de manera estable por la célula, el ADN plasmidial debe contener un origen de replicación, que permitirá la replicación en la célula, independientemente del cromosoma. Debido a que la transformación usualmente produce una mezcla de inusuales transformaciones y abundantes células no-transformadas, se necesita de un método para identificar las células que han adquirido el plásmido. Los plásmidos utilizados en este tipo de experimentos, contienen usualmente un gen que les otorgue resistencia a un antibiótico. La cepa bacteriana a transformar, debe ser sensible a éste. Las células capaces de crecer en un medio de cultivo con este antibiótico, serán las que han sido transformadas por el plásmido, y las células que no puedan crecer carecerán de éste.

En éste tipo de transformación, la región que contiene el sitio múltiple de clonamiento, o sitio polylinker, reside en el fragmento del gen lacZ-α, lo que significa que los plasmidios recombinantes tendrán el gen deseado insertado en alguna parte dentro de lacZ-α. Cuando este fragmento genético interrumpido sea expresado por la E. coli, no se producirá una proteína lacZ-α utilizable, por lo que no se formará β-galactosidasa utilizable.

Las bacterias que tengan el plásmido pero éste no tengan la secuencia recombinante pueden romper el X-gal presente en el agar del medio, tornándose suscolonias de color azul. Las bacterias que han sido transformadas, no pueden procesar X-gal y permanecen con su coloración blanca natural.

El plásmido comercial pUC18/19 sirve para clonar en E. coli.
Transformación bacteriana
Se prepararon previas células de E. coli competentes mediante el protocolo de Cloruro Cálcico. Se congelaron.

Descongele las células competentes de E. coli en hielo.

Prepare 2 tubos 1.5 ml. Rotule con - el tubo de control negativo y ? para el tubo problema. Agregue 50μL de células E. coli competentes a cada tubo.

En el tubo negativo ponemos 1 ul de agua destila esteril, en el tubo problema ponemos 1 ul que contiene el plásmido pUC18/19. Mezclar pipeteando dos o tres veces.

Incube los tubos en hielo durante 10 minutos.

Genere un shock de calor al colocando el tubo en el termobloque a 42°C durante 30 segundos.

Luego coloque rápidamente los tubos en hielo durante 2 minutos.

Añada a cada tubo 1 ml de medio SOC precalentado a 37°C

Incube a 37 ° C,  si es posible con una agitación de 200 rpm, durante 30 min.

Distribuya 100 ul de las diluciones 1:10 del control negativo y 1:10 y 1: 100 del tubo problema en placas Petri de LB preparadas con 100 ug/ml de ampicilina. Por paralelo se siembra una placa de LB sin ampicilina para comprobar que las E. coli competentes son viables.

Incube a 37 ° C durante 12-16 horas.

Inspeccione las placas para observar presencia de colonias transformadas.

Preguntas de repaso: 

1. ¿Qué ocurriría si, en un experimento de transformación como el que tenemos descrito arriba, no añadimos antibiótico a las placas Petri?
2. ¿Qué función tiene en el plásmido la región de clonación múltiple "MCS"?
3. En un tubo Eppendorf tengo 1 ml de cultivo con 1x104 bacterias. He hecho un experimento de transformación con un plásmido. Por experimentos anteriores se que mi tasa de transformación es de 1 bacteria cada 10 millones de bacterias. Hago una dilución 1/1000 y siembro 10 ul de esa dilución. ¿Cuántas bacterias tendré en mi placa con antibiótico?

Solución: cero porque con solo 10.000 bacterias en el tubo y una tasa de transformación de 1 cada 10.000.000 lo más normal es no tener bacterias transformadas

4. En un tubo Eppendorf tengo 1 ml de cultivo con 1x1014 bacterias. He hecho un experimento de transformación con un plásmido. Por experimentos anteriores se que mi tasa de transformación es de 1 bacteria cada 10 millones de bacterias. Hago una dilución 1/1000 y siembro 10 ul de esa dilución. ¿Cuántas colonias tendré en mi placa con antibiótico?

Solución: 100 colonias

5. En un tubo Eppendorf tengo 1 ml de cultivo con 1x1014 bacterias. He hecho un experimento de transformación con un plásmido. Por experimentos anteriores se que mi tasa de transformación es de 1 bacteria cada 10 millones de bacterias. Hago una dilución 1/100 y seguidamente otra dilución 1/100 y siembro en una placa LB con antibiótico 100 ul de esa dilución. ¿Cuántas colonias tendré en mi placa con antibiótico?

Solución: 100 colonias

6. En un tubo Eppendorf tengo 1 ml de cultivo con 1x1014 bacterias. He hecho un experimento de transformación con un plásmido. Por experimentos anteriores se que mi tasa de transformación es de 1 bacteria cada 10 millones de bacterias. Hago una dilución 1/100 y seguidamente otra dilución 1/100 y siembro en una placa LB con antibiótico 100 ul de esa dilución. Me olvidé, porque soy humano, de poner antibiótico en las placas de LB ¿Cuántas colonias tendré ahora?

Solución: 1000 millones de colonias

Para saber más:

https://jemi.microbiology.ubc.ca/node/127

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