1 Centrifugamos el lisado en la centrífuga a 5000 rpm, 5 min, 4ºC. Tomamos el sobrenadante que es donde se encuentran los virus
2 Añadimos Triton X-100 a los sobrenadantes del lisado hasta obtener una concentración final del 1 % (de un stock al 10 ó 20 %). Triton X100: es un detergente no iónico usando para desnaturalizar membranas de células sin desnaturalizar la proteína. De esta manera lisamos las células que pudiese haber todavía en el primer sobrenadante
3 Centrifugamos el lisado en la ultracentrífuga de tubos basculantes a 17 000 rpm, 50 min, 4 ºC. Deseche los sobrenadantes.
4 Vuelva a suspender los sedimentos de virus con un pequeño volumen de Tris-HCl 50 mM, pH 7,8
*Aproximadamente 1,0 mL por 100 mL de lisado
5 Coloque la suspensión de virus en capas sobre gradientes lineales de sacarosa de 100-400 mg/mL (10-40 %) equilibrados con Tris-HCl 50 mM fabricado en tubos de polipropileno (capa de aproximadamente 3-4 ml por gradiente).
*Para hacer el stock de sacarosa, agregue 10-40% de sacarosa a Tris-HCl y autoclave.
6 Centrifugar los gradientes en la ultracentrífuga a 20.000 rpm, 20 min, 4ºC. El virus será la banda principal alrededor de 1/2 a 2/3 de profundidad en el degradado.
7 Retire las bandas de virus de los gradientes con agujas estériles y se transfieren a tubos de centrífuga de polipropileno de 30 ml. Diluya lentamente el virus al volumen del tubo con Tris-HCl 50 mM. Centrifugar los tubos en el ultracentrífuga a 27.000 rpm, 3 horas, 4ºC. Deseche los sobrenadantes.
8 Vuelva a suspender el pellet en donde se encuentran los virus con un pequeño volumen de Tris-HCl 50 mM. Conservar el virus a 4ºC. No congelar. Esterilización por filtración con filtros de celulosa de 0,45 um
Para saber más:
