Broiler Farms and Carcasses Are an Important Reservoir of Multi-Drug Resistant Escherichia coli in Ecuador

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Broiler Farms and Carcasses Are an Important Reservoir of Multi-Drug Resistant Escherichia coli in Ecuador. 2020. Ortega-Paredes, D, de Janon S, Villavicencio F, Jaramillo Ruales K, De La Torre, K, Villacís, JE, Wagenaar, JA, Matheu J, Bravo-Vallejo C, Fernández-Moreira E and Vinueza-Burgos, C. Frontiers in Veterinary Science. 7:979. https://doi.org/10.3389/fvets.2020.547843

Colonias enanas de Escherichia coli ¿Son frecuentes en los urocultivos?

Se sabe que bacterias nutricionalmente deficientes o auxotroficas causan dificultades en su aislamiento, identificación, o antibiograma como resultado de su dependencia de varios factores de crecimiento para lograr una morfología colonial y tasa de crecimiento normales. Estas bacterias incluyen estreptococos dependiente de piridoxal; Staphylococcus aureus dependiente de hemina, tiamina, pentotenato o menaquinona; E. coli, Proteus mirabilis; Salmonella typhimurium, y Streptococcus pneumoniae dependiente de timina. También, microorganismos dependiente de cisteina, tales como E. coli y Klebsiella pneumoniae, se han notificado como patógenos ocasionales del tracto urinario. 

Aislamientos de Escherichia coli dependientes de cisteína asociados con la infección del tracto urinario son ahora bien reconocidos. Medios suplementados con cisteína han sido especialmente formulado para detectar estas cepas. Las cepas de la familia Enterobacteriaceae que son auxotroficas para cisteína debido a defectos en la asimilación de los sulfatos representan alrededor del 1,5% de los aislamientos significativos de infecciones de las vías urinarias, y también en ocasiones aisladas desde otros sitios corporales. Ciertos componentes de peptona de los medios bacteriológicos son deficientes en cisteína o de su producto de la oxidación, cistina, y en consecuencia el crecimiento de las cepas que son auxótrofas para estos aminoácidos es subóptima, causando problemas en su aislamiento, identificación, y las pruebas de sensibilidad. Estos microorganismos crecen pobremente en los medios de aislamiento y forman las llamadas "colonias enanas" ("dwarf colonies").
                                   
Las cepas de E. coli dependiente de cisteína representan alrededor del 2% de todos los aislamientos de esta especie en las infecciones del tracto urinario y son más frecuentemente recuperados de pacientes ancianos con infecciones crónicas del tracto urinario y/o con anormalidades del tracto urinario. La transformación de Escherichia coli de prototrofos a auxotrofos es engrandecido bajo condiciones de exceso de cisteína y otro componentes de sulfuro que se ve en la orina de pacientes con disminución de función renal, o paciente con prolongado tratamiento con cotrimoxazol (combinación de trimethoprim y sulfametoxazol). Los aislamientos requiriendo cisteína han mostrado la falta de capacidad de asimilar sulfato, como una función de la vía de asimilación de sulfuro resultando en la formación de cisteína. 

Los medios de laboratorio comúnmente incorporan peptona en sus composiciones. Estas peptonas no son totalmente caracterizadas en lo que se refiere a su contenido de aminoácidos o a su concentración. La cisteína es normalmente desnaturalizada durante la producción de peptonas, por lo que un medio suplementado con cisteína se ha desarrollado para facilitar el aislamiento de auxótrofos de cisteína, el agar CLED (Cisteina-Lactosa- Deficiente en Electrolitos). Las cantidades de cisteína que permiten el máximo rendimiento de crecimiento de auxotrofos pero sin efectos tóxicos en el crecimiento de las cepas auxotróficas y prototroficas se han determinado en dichos medios. La presencia de E. coli dependiente de cisteína en la orina o sangre frecuentemente es una indicación de una condición renal subyacente y debe motivar la búsqueda de ella asociadas a tales condiciones. Sin embargo, los informes publicados de estos microorganismos son pocos y en Latinoamérica son escasos

Bibliografia:

http://jmm.sgmjournals.org/content/39/5/382.full.pdf

http://jcm.asm.org/content/41/12/5689.full.pdf

http://bacteriasactuaciencia.blogspot.com/2019/09/cistitis-recurrentes-en-ancianos-y.html

Práctica infecciones de vías urinarias

La presencia de microorganismos en las vías urinarias asociado a sintomatología clínica es definida como infección de vías urinarias (IVU), el hallazgo de sintomatología es fundamental ya que ayuda diferenciar de otra patología conocida como bacteriuria asintomática la cuál es considerada clínicamente relevante en casos puntuales como en mujeres embarazadas. Es importante definir si la infección urinaria es alta (pielonefritis) o baja (cistitis, prostatitis), así como si es de origen intrahospitalario (sospechar patógenos multirresistentes) o comunitario (optimización de antibióticos), Siendo relevante ya que se considera que entre el 50 a 60 % de mujeres adultas presentarán una IVU por lo menos un episodio en su vida.

Varios uropatógenos pueden infectar las vías urinarias y la prevalencia puede variar de país a país, en mujeres con cistitis comunitaria predomina Escherichia coli con una prevalencia entre 80 a 85 %, el porcentaje restante suele asociarse a Staphylococcus saprophyticus (cititis de luna de miel), Proteus mirabilis (asociado a litiasis renal), Streptococcus agalactiae (prevalente en mujeres embarazas, puede causar neumonías en neonatos) y especies de Klebsiella (importante por resistencia intrínseca a ampicilina, presencia de betalactamasas y carbapenemasas tornándola una bacteria resistente a antibióticos). Por otro lado, a nivel hospitalario diversos procedimientos (sonda urinaria, procesos quirúrgicos) predispone a infecciones por bacilos gramnegativos como Proteus, Klebsiella, Serratia y Pseudomonas.

Una cistitis debe ser descartada ante un paciente con dolor al orinar (disuria), aumento de la frecuencia urinaria (polaquiuria), mantener las ganas de miccionar pese al acto urinario (tenesmo), entre otros (hematuria, nicturia, incontinencia, etc). Se debe diferenciar de una pielonefritis, ya que la infección renal suele asociarse con fiebre, dolor a la puñopercusión lumbar y síntomas sistémicos. Posterior al diagnóstico clínico este debe ser corroborado con exámenes de laboratorio para lo cual se debe solicitar un examen elemental y microscópico de orina (EMO), además de un urocultivo y antibiograma.

Esta práctica se fundamentará en el análisis microbiológico de la orina para la detección de patógenos por medio del urocultivo. El urocultivo significativo (micción espontánea > 100.000 (UFC/mL) llega a ser de fundamental importancia debido a que ayuda a conocer la prevalencia local de patógenos, influye en la terapia antibiótica y motiva la decisión de cambio (rotar) del fármaco en aislados resistente o multirresistentes (resistencia a más tres familias de antibacterianos).

Objetivos de la práctica

1. Valorizar la importancia de la Tinción Gram en la instauración de terapia de antibióticos.
2. Conocer los puntos de corte para infección urinaria de acuerdo a sexo, edad, sintomatología y método de recolección de la muestra.
3. Determinar la importancia del examen elemental, físico-químico y microscópico de orina.
4. Analizar y determinar la importancia del crecimiento de uropatógenos en medios de
cultivo.
5. Aprender a utilizar la metodología adecuada para la realización de urocultivos.

Los resultados de la práctica: 

1. Tinción Gram.

2. Tira Combur-Test

3. Identificar morfología de colonias en agares CLED, Sangre y MacConkey.

4. Realizar el conteo de colonias del agar CLED y agares Sangre/MacConkey

5. Identificar morfología de colonias en demostrativo de agar cromogénico UTIC

Recursos adicionales • Muestra de orina por grupo, provista por los estudiantes. • Cultivos bacterianos en medio cromogénico UTIC con E. coli, Proteus spp, Klebsiella spp, Enterococcus spp, 

Descripción del procedimiento 

SESIÓN 1

1. Recolectar una muestra de orina fresca en un frasco estéril de boca ancha. La muestra no debe tener más de 2 horas de antigüedad. 

2. Sembrar con asa estéril de 10 uL de orina en cajas de agar. Sembramos las placas. Siempre desde el medio menos selectivo al medio más selectivo. Primero agar Sangre, agar MacConkey y agar CLED.

Usar técnica de estriado semicuantitativo que permita el contaje de colonias y obtener la densidad celular original (Original Cell Density, OCD). Mantener una técnica aséptica para evitar contaminaciones. 

En la siembra semicuantitativa siembro en Z por que parto de un inóculo pequeño (10ul). Primero se toma de la muestra de orina con un asa y siembro en el centro de la placa (siguiendo la flecha) y luego estrío de la manera indicada.

3. Realizar el test de parámetros de orina. Sumergir la tirilla por 1 minuto y anotar los resultados 

4. Transferir 5mL de muestra del frasco estéril a un tubo de ensayo estéril. 

a. Centrifugar a 3500 RPM por 5 minutos. 

b. Descartar 4 mL de sobrenadante tratando de no afectar sedimento. 

c. Realizar una tinción Gram del sedimento urinario.

SESIÓN 2

1. Identificar morfología de colonias en agares CLED, Sangre y MacConkey.

2. Realizar el conteo de colonias del agar CLED y agares Sangre/MacConkey. Calcular OCD
y reportarlo en CFU/mL.
3. Identificar morfología de colonias en demostrativo de agar cromogénico UTIC con cultivos
de E. coli, Proteus spp, Klebsiella spp, Enterococcus spp, Staphylococcus saprophyticus,
Streptococcus agalactiae.

Datos a ser registrados y el método de análisis y de presentación de resultados.

• Relacionar los datos obtenidos de la tirilla de parámetros físico-químicos de la muestra
de orina con la tinción Gram de sedimento de orina y el conteo de colonias realizado a
partir del cultivo semicuantitativo para determinar posibilidad de infección urinaria.

• Reportar características morfológicas de colonias en agares específicos CLED, Sangre,
MacConkey.

• Reportar características morfológicas de colonias en agares específicos UTIC.

CUESTIONARIO

PREGUNTA 1 ¿Por qué uso el agar CLED? ¿Qué componentes tiene? ¿Qué mejora el agar CLED con respecto al MacConkey para los urocultivos?

PREGUNTA 2: ¿Qué uropatógeno voy a aislar en agar sangre?

PREGUNTA 3: Medios cromogénicos ¿Qué son? ¿En qué se basan?

PREGUNTA 4: ¿Por qué sembramos las placas siempre desde el medio menos selectivo al medio más selectivo?

PREGUNTA 5: ¿Qué indica la presencia de nitritos en la muestra de orina?

¡Nos vamos a poner la vacuna los últimos!

 Las multinacionales no tienen bandera. Dicen. Pero si que la tienen. Allá donde tengan la sede principal, que es donde vive el príncipe, es decir, los accionistas mayoritario, los dueños del negocio, será donde tengan su bandera ¿Qué significa esto? que una multinacional no va a tratar igual a los clientes de su país de origen que a los de otros países. En otras palabras: ¡Primero ellos!

Por ese motivo, es esencial que los países latinoamericanos cuenten con su propia industria farmacéutica, para no ser los últimos en llegar a las vacunas

Práctica infecciones del tracto gastrointestinal

El tracto gastrointestinal alberga una población compleja y dinámica de microrganismos (bacterias, virus, hongos y parásitos conocida actualmente como microbiota del tracto gastrointestinal). Las interacciones entre la microbiota y el hospedador son responsables de los estados de homeostasis o enfermedad. Uno de los grupos bacterianos, más estudiados y abundantes en el intestino es la familia Enterobacteriaceae. Se trata de bacilos Gram negativos, mesofílicos, no fastidiosos, que tienen la capacidad de reproducirse fácilmente en agua y alimentos. Por lo tanto, el acceso a estos microorganismos principalmente ocurre por vía digestiva. No todas las enterobacterias son patógenos estrictos, pero aquellas que sí lo son incluyen a Salmonella, Shigella y serovariedades de Escherichia (ETEC, STEC, EHEC, por mencionar algunas). Generalmente Klebsiella, Enterobacter y Proteus son enterobacterias que pertenecen a la microbiota normal del tracto gastrointestinal, pero que bajo condiciones adecuadas (ingreso a otros tejidos o adquisición de factores de virulencia) pueden causar enfermedades localizadas o sistémicas.

La gastroenteritis bacteriana es una enfermedad muy frecuente tanto en países desarrollados como en aquellos en vías de desarrollo. A pesar de que la mayoría de las gastroenteritis son autolimitadas, es decir, de origen vírico. Por ese motivo, ante un caso de diarrea se debe observar al microscopio para observar si hay leucocitos en las muestras fecales. Si existen leucocitos entonces sospechamos una diarrea originada por patógenos bacteriano y procedemos a sembrar en medios selectivos para obtener colonias de la bacteria causante de la diarrea. El estudio de una muestra de heces fecales ayuda a identificar el agente causal cuando hay síntomas de enfermedad invasiva, diarrea prolongada, diarrea crónica o enfermedad grave. Por lo tanto, el cultivo de heces es una herramienta importante para entender la microbiología de enfermedades gastrointestinales. Además, el entendimiento y mapeo de un brote de gastroenteritis tiene como base la caracterización de los agentes etiológicos involucrados.

La prueba de la oxidasa es a los Gram negativos lo mismo que la catalasa a los Gram positivos. Toda la familia Enterobacteriaceae son oxidasa negativos excepto el género Plesiomonas que pertenecen a los Enterobacteriaceae pero son oxidasa positivo. Las Plesiomonas no son patógenos estrictos por lo que no nos debemos preocupar de este género.

Ejemplos de problemas gastrointestinales provocados por bacterias

Las infecciones gastrointestinales se pueden producir por multiples patógenos. Las aves son reservorios de Salmonella spp, por ese motivo NUNCA LAVES EL POLLO, ya que ayudas a que la bacteria se esparza por tu cocina. Las bacterias se mueren cuando se cocinan.

Hay toxinas termoresistentes que no se eliminan con la cocción

Salmonella typhi causan diarrea a veces, otras incluso estreñimiento, pero pueden diseminarse por el torrente sanguíneo. Si sospechamos de fiebre tifoidea tenemos que analizar el coprocultivo.

Shigella disenteriae, es importante en los niños pequeños que puede provocar problemas neurológicos

Objetivos
Estrategias metodológicas para el diagnóstico de infecciones gastrointestinales, tomado en cuenta la correcta toma de muestra, transporte, procesamiento e interpretación de resultados .

Alcance
La práctica cubre desde la obtención de una muestra de calidad (heces), transporte, procesamiento hasta el reporte e interpretación de resultados.

Requisitos previos a la realización de la práctica
Leer de manera comprensiva la prácticas: tinción Gram, toma de muestras, y sobre todo siembra, aislamiento y caracterización de bacterias.
Leer y traer impreso a la práctica el manual de usuario de los cassettes de pruebas bioquímicas en micrométodo Microgen GNA

Aparatos, equipos e instrumentos
Microscopio binocular, mechero Bunsen e incubadora

MEDIOS.

Cajas bipetri Agar MacConkey

El medio MacConkey impide que crezcan bacterias Gram + y sirve para distinguir bacterias Gram - que fermenten o no la lactosa: A Colonias Lac - B colonias Lac +

Tubos de medios

1 Caldo MR-VP (caldo rojo de metilo) 2 Agar Base Urea 3 Agar Hierro lisina 4 Agar Citrato de Simmons 5 Agar SIM  6 Agar TSI

Cassettes de pruebas bioquímicas Microgen GNA

Recursos adicionales

Cajas bipetri de Agar nutritivo con 2 cepas bacterianas patógenas gastrointestinales

(Cepa 1 y Cepa 2) 

Cajas bipetri con agar Salmonella Shigella con Cepa 1 y Cepa 2 

SESIÓN 1

Se inocula con aguja los medios TSI, SIM y hierro Lisina. Para inocular los medios urea, citrato, MR-VP usamos el asa de inoculación.

Micrométodo GNA: Se toman 3 colonias aisladas de una de las cepas bacterianas y colocarla en un tubo con solución salina (3ml). A partir de esta suspensión colocar 3 gotas de la solución salina en cada uno de los pocillos del cassette Microgen. En todos los pocillos con línea negra colocar 1 gota de aceite mineral (parafina). Se vuelve a cerrar los pocillos con el parafilm que quitamos al principio. Incubar 24 horas a 37°C.

SESIÓN 2

Fermentación de la lactosa: Observar los resultados de las siembras en agar Mac Conkey.

Prueba oxidasa: Con un palillo de dientes, recoger una colonia aislada y esparcirla sobre la tira de oxidasa. Reporte sus observaciones.

Tinción Gram: usando bacterias de la siembra realizada en agar Mac Conkey.

Batería química convencional: Colocar reactivo de Kovacs en el medio SIM. Dividir el caldo de cultivo MR-VP en 2 tubos. a. En el primero colocar reactivo MR. b. En el segundo tubo colocar el reactivo VP 1 y reactivo VP 2. Finalmente, registrar los resultados de la batería química convencional (TSI, SIM, urea, citrato, MR-VP, lisina).

Micrométodo – Microgen GNA: Colocar los siguientes reactivos: Reactivos de Kovacs en el pocillo 8. Reactivo VP 1 Reactivo VP2 en el pocillo 10. Reactivo TDA en el pocillo 12. Revelar en el tiempo adecuado según el inserto de Microgen. Ingresar el código en el software e interpretar los resultados

Datos a ser registrados y el método de análisis y de presentación de resultados. Usar la Tabla de interpretación de resultados de la batería bioquímica para enterobacterias para la realización del informe de laboratorio. Organizar los resultados de la batería bioquímica convencional, agar MacConkey, test de oxidasa y tinción Gram en una tabla. Incluir dibujos de los resultados en la tabla de interpretación de resultados de la batería bioquímica para enterobacterias

Dibujar el cassette de reacciones Microgen con los resultados obtenidos en la práctica.

Con los resultados obtenidos identificar hasta género (y si es posible, hasta especie) el microorganismo

de la Cepa 1 y de la Cepa 2.

CUESTIONARIO

PREGUNTA 1: ¿Por qué se inocula con aguja los medios TSI, SIM y hierro Lisina? ¿Qué ocurriría si se utilizase un asa de siembra?

PREGUNTA 2: ¿Cómo siembro el agar TSI? ¿Por punción o estrías? ¿Como siembro el agar SIM?

PREGUNTA 3: Cuando siembro agar SIM ¿Qué respuestas nos va a dar el crecimiento en este medio?

PREGUNTA 4: Cuando siembro agar TSI ¿Qué respuestas nos va a dar el crecimiento en este medio?

PREGUNTA 5: Las pruebas de oxidasa se realizan tomando las colonias con un palillo ¿Por qué?

PREGUNTA 6: ¿Por qué no hacemos la prueba de la catalasa cuando tenemos un bacilo Gram negativo?

PREGUNTA 7: ¿Cómo consigue el medio MacConkey evitar que crezcan las bacterias Gram positivas?

Práctica infecciones de vías respiratorias

El tracto respiratorio se extiende desde las fosas nasales hasta los alvéolos pulmonares, está

habitado por diversas comunidades bacterianas. 

El aparato respiratorio comprende dos regiones: Tracto superior: cavidad nasal, faringe, laringe. El tracto inferior lo constituyen tráquea, bronquios y los pulmones.El microbioma respiratorio es dinámico y está influenciado por factores ambientales y del huésped. 

El tracto respiratorio superior está colonizado por comunidades bacterianas, virus y hongos que en conjunto forman una barrera para evitar la colonización de agentes patógenos y ayudar al entrenamiento del sistema inmune. Muchas partes se encuentran cubiertos por cilios y moco que funciona como filtro. Allí donde hay moco, como en la cavidad nasal, las enfermedades (rinitis) están asociadas a virus y no a bacterias. Las bacterias suelen colonizar lugares sin tanta segregación de moco como la faringe.

El tracto inferior carece de flora residente y es muy susceptible a enfermedades e infecciones. Los dos pulmones de un humano adulto cuentan con más de 500 millones de alvéolos, si se estirasen completamente ocuparían una superficie de 80 metros cuadrados. Los microorganismos que se pudieran encontrar son microbios “de paso” y el escalador mucociliario se encarga de expulsarlos. Hasta hace bien poco se consideraba que no deben existir microorganismos en los pulmones sanos. Gracias a los estudios de microbioma sabemos que existen bacterias en los pulmones. Las funciones de los pulmones no permitieron desarrollar barreras físicas que se presentan en otro sistemas. El intercambio de gases, calentamiento y humectación de los gases que ingresan y salen de nuestro cuerpo requieren de una capa delgada en contacto con el sistema circulatorio. 

En los pulmones solo funciona el sistema inmunológico innato a través de la actividad de los macrófagos. El sistema inmune humoral no funciona en el tracto inferior porque su actividad, que comprende la inflamación, haría que el pulmón no pudiese intercambiar gases y el individuo moriría por asfixia.

Las especies bacterianas típicas que componen la microbiota de la nasofaringe incluyen Moraxella, Staphylococcus, Corynebacterium, Streptococcus. La orofaringe está colonizado por Streptococcus, Prevotella, Neisseria, Veillonella, Rothia, Leptotrichia entre otros.

Basándonos en la secuencia del gen 16SrRNA, los estreptococos se clasifican en 5 grandes grupos: 

piógeno, mitis, angiosus, salivarus y bovis

La clasificación de los Streptococos se debe a Rebecca Lancefield. Se basa en las reacciones serológicas de los carbohidratos de la pared celular de la bacteria, es decir, en la distinta naturaleza antigénica de 

los polisacáridos de la pared

Patrones de hemólisis: La hemólisis alfa se refiere a una lisis parcial de eritrocitos que produce una coloración verde que se observa alrededor de las colonias. Esta lisis es debida a la liberación de  una alfa-hemolisina que degrada la hemoglobina dando un color verde alrededor de la colonia cuando desarrolla en agar sangre. La hemólisis beta se refiere a un halo de hemólisis completamente claro debido a Las hemolisinas que son enzimas que lisan los hematíes. Por último, la hemólisis gama se refiere a la ausencia de hemólisis. 

Grupo piógeno

En el grupo piogénico, basándonos en el tamaño grande de la colonia, en la reacción hemolítica en 

placas de sangre y en la detección de antígeno de grupo de Lancefield, es fácil identificar los e

streptococos betahemolíticos más comunes: S. pyogenes (grupo A) y S. agalactiae (grupo B)

S. pyogenes

S. pyogenes no presenta grandes problemas en su identificación. Se trata de colonias betahemolíticas, 

que generalmente son sensibles a la bacitracina. S. pyogenes. Inhalación de partículas de enfermos y 

portadores (humanos, perros y otros animales de compañía). Se diseminan por tos, estornudos, comida

y bebida contaminadas. Algunas cepas de S. pyogenes pueden estar infectadas con fagos (producen 

toxina speA ) y producir fiebre escarlatina.

S. agalactiae

Existen varios medios de cultivo selectivos para la detección de S. agalactiae, recomendados para el 

cribado de colonización por estreptococos del grupo B en mujeres embarazadas. El medio Granada 8 es 

de interpretación sencilla y tiene una sensibilidad y especificidad elevadas. Se basa en la detección del 

pigmento carotenoide que expresa la mayoría de los estreptococos de este grupo. El crecimiento de 

colonias de color naranja, tras incubación en anaerobiosis, nos indica la presencia de S. agalactiae. Hay 

que tener en cuenta que, aproximadamente, un 5% de los aislamientos suelen ser cepas no hemolíticas y 

no pigmentadas, por lo que no serían detectadas con este medio.

Grupo mitis

S. pneumoniae

Las colonias de neumococo son características, producen alfahemólisis (por peróxido de hidrógeno) y, 

si se prolonga algo la incubación de las placas, el centro de las colonias aparece ligeramente deprimido 

como resultado de la autólisis

.

Se identifican presuntivamente por su sensibilidad a la optoquina, junto a su solubilidad en sales biliares y una reacción catalasa negativa. Su diagnóstico etiológico se recomienda la tinción de Gram y el cultivo de esputo. Cuando se observan menos de 10 células escamosas y aparecen más de 25 polimorfonucleares por campo a 100 aumentos (grados IV y V de Murray y Washington) el esputo es adecuado

 

Muchas cepas de Streptococcus pneumoniae viven comensales en el tracto respiratorio superior. ¿Por qué de repente se vuelven infecciosos y colonizan los pulmones? S. pneumoniae, cuando detecta virus en su ambiente aumenta el número de su población y desarrolla una capa mucosa que le permite colonizar el pulmón y evitar a los macrófagos. La capa mucosa o cápsula es un factor de virulencia y su presencia o ausencia sirvió para demostrar en 1944 que el ADN era la molécula portadora de la herencia genética.

Objetivo de la práctica

Identificación de Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae por medio de sus características bioquímicas y patrón de sensibilidad antimicrobiana.

Alcance

La práctica cubre desde la obtención de una muestra de calidad (exudado faríngeo y nasal),

transporte, procesamiento hasta el reporte e interpretación de resultados (fases preanalítica,

analítica y post analítica).

Aparatos, equipos e instrumentos: microscopio óptico, mechero Bunsen, incubador 37º e incubador 37º 

C, 5%-7% CO2

Recursos adicionales

Caldo de cultivo Todd Hewitt con cepas bacterianas de Streptococcus pneumoniae (x9).

Caldo de cultivo Tripticasa Soya con cepas bacterianas de Streptococcus pyogenes (x9).

Descripción del procedimiento

SESION 1

1. Etiquetar en la base de una caja bipetri “S. pneumoniae” en una mitad y “S. pyogenes” en la

otra mitad.

2. Realizar técnica de estriado en la caja bipetri de sangre de S. pneumoniae y S. pyogenes,

en sus respectivas mitades para obtener colonias aisladas.

2.1. Sumergir el asa bacteriológica estéril en la solución bacteriana.

2.2. Realizar el estriado. NO VOLVER A TOMAR MUESTRA ENTRE ESTRIADOS.

3. En una segunda caja bipetri con agar sangre etiquetar en la base “S. pyogenes”. En una

mitad etiquetar “optoquina” y en la segunda mitad “bacitracina”.

3.1. Repetir el proceso con S. pneumoniae en una tercera caja bipetri.

4. Realizar técnica de cultivo en “césped” en la caja de S. pneumoniae y en la de S. pyogenes.

4.1. Sumergir un hisopo estéril en la suspensión bacteriana.

4.2. Eliminar el excedente presionando el hisopo contra las paredes del tubo antes de

retirarlo.

4.3. Pasar el hisopo por el agar sangre realizando un zigzag muy cerrado. Girar 90° y volver

a realizar el procedimiento.

5. Colocar los discos de antibióticos en sus respectivas mitades.

5.1. Calentar la punta de las pinzas al rojo vivo y dejar enfriar.

5.2. Tomar con cuidado un disco de optoquina y colocarlo en la mitad del agar.

5.3. Calentar la punta de las pinzas al rojo vivo y dejar enfriar.

5.4. Tomar con cuidado un disco de bacitracina y colocarlo la mitad del agar.

5.5. Repetir el proceso con la otra caja bipetri con cultivo en césped.

6. Cada equipo de trabajo debe realizar una toma de muestra nasofaríngea y orofaríngea.

6.1. Etiquetar la base de una caja Petri con agar sangre con “Nasofaríngeo” y “Orofaríngeo”.

6.2. Tomar la muestra de acuerdo a la técnica explicada

Hisopado orofaringeo y nasofaringeo (min. 3:20). Fuente: PAHO TV

Exudado faríngeo.

El cultivo faríngeo es el método estándar para documentar la presencia de S. pyogenes en la

faringe, esta prueba alcanza una sensibilidad del 90 a 95%.

Condiciones previas del paciente

• El paciente no debe haber recibido antibióticos en los últimos 8 días, previos a la obtención de

la muestra.

• El paciente debe acudir en ayunas al laboratorio.

• Debe cepillarse los dientes y no practicar gargarismo.

Procedimiento

1. Inspección de la faringe: ubicar al paciente en una posición cómoda y con buena iluminación,

deprimir la lengua con el bajalenguas, visualizar la fosa amigdalina y faringe en busca de

exudado posterior, presencia de pseudomembrana o placas

2. Indicar al paciente que abra la boca y que pronuncie un largo “ah”, el cual sirve para elevar

la úvula y evitar las náuseas.

3. Introducir el hisopo y frotar enérgicamente ambas amígdalas y la pared posterior de la faringe

con movimientos de barrido.

4. Retirar el hisopo cuidando de no tocar las paredes laterales de orofaringe, úvula, lengua,

encías y dientes.

5. Extender la muestra con suaves movimientos sobre la superficie de los portaobjetos para

realizar los frotis que serán teñidos al Gram.

6. Obtener un segundo hisopado de fauces para la siembra en Agar Sangre de carnero, Girar

la cabeza del hisopo y presionar ligeramente contra una zona pequeña del extremo de la

caja Petri.

7. Estriar por agotamiento con un asa previamente esterilizada para obtener colonias aisladas.

8. Incubar el agar sangre a 37°C, en condiciones de 5-7% CO2, por 24-72 horas.

Observación: En caso de ser necesario, la muestra se podrá transportar en medio de Stuart o

Amies, realizando el cultivo de la misma en el menor tiempo posible (menos de 2 horas).

Interpretación del examen directo

Gram: describir los hallazgos de células inflamatorias, la morfología y disposición bacteriana

presente (ejemplo: cocos Gram positivos en cadena, bacilos Gram negativos fusiformes) así

mismo reportar la presencia de células levaduriformes, hifas y pseudohifas.

SESIÓN 2

1. Bipetri estriada con S. pneumoniae y S. pyogenes:

1.1. Observar las características morfológicas de las colonias.

1.2. Hemolisis de cada una de las cepas.

1.3. Realizar la prueba de catalasa de ambas cepas bacterianas.

1.4. Reportar resultados en la Tabla de características microbiológicas observadas.

2. Bipetris con discos antibióticos: interpretar resistencia y susceptibilidad a los antibióticos

optoquina y bacitracina.

2.1. Medir diámetros de los halos (si los hay).

2.2. Registrar los resultados y su interpretación (Resistente o Susceptible) en la Tabla de

respuesta a antibióticos.

3. Muestras nasofaríngea y orofaríngea:

3.1. Identificar las características morfológicas de cada una de las colonias aisladas

(escoger mínimo dos morfologías diferentes)

3.2. Realizar tinción Gram.

3.3. Realizar prueba de catalasa.

3.4. Con los datos obtenidos identifique de manera presuntiva el género y la posible especie

de las bacterias aisladas.

3.5. Registrar resultados en la Tabla de características morfológicas y microbiológicas de

muestras nasofaríngeas y orofaríngeas.

Datos a ser registrados y el método de análisis y de presentación de resultados.

Género Streptococcus: una revisión práctica para el laboratorio de microbiología

Géneros Streptococcus y Enterococcus

Cuestionario: 

PREGUNTA 1: ¿Mediante qué mecanismo S. pneumoniae lisa los eritrocitos?

PREGUNTA 2: ¿La clasificación de Lancefield en qué está basada?

PREGUNTA 3: ¿Por qué el patrón de hemólisis es útil para clasificar estreptococos?

PREGUNTA 4: En referencia a las características generales de los Streptococcus. Señale la opción 

correcta. Puede haber más de una opción correcta o ninguna. Justifique cuando 

una opción es incorrecta:

a) Son cocos Gram-positivos agrupados en cadena.

b) Tienen crecimiento rápido y forman colonias al cabo de 24-36 horas de cultivo.

c) Sólo pueden oxidar los azúcares, no pueden fermentarlos.

d) Son bacterias con mínimos requerimientos nutricionales y pueden crecer en medios pobres.

e) Dan reacción positiva a la prueba de la catalasa.

f) Se las denomina fastidiosas porque las cepas con importancia médica desarrollan más

lentamente.

g) Una de las especies beta hemolíticas con mayor importancia médica es S. pneumoniae.

a) Correcta, en cadenas y en diplococos

b) Correcto. Aunque pueden aparecer cultivos tras 18 horas

c) Correcto, los bacilos son fermentadores de lactosa

d) Verdadero, se las puede cultivar en medio solidos

e) Falso. Todas las especies de Streptococcus son catalasa negativa y Staphylococcus son catalasa 

positivo

f) Verdadero, S. pneumonie puede ser considerada una bacteria fastidiosa ya que tiene requerimientos 

nutricionales específicos

g) La más importante Beta hemolíticos es Streptoccocus pneumoniae

PREGUNTA 5: ¿Por qué el patrón de hemólisis es útil para clasificar estreptococos?

Resultado: Porque nos permite dividir a los Streptococcus según su patrón de lisis de los eritrocitos. 

Existen Streptococcus alfa hemolíticas que producen una hemólisis incompleta, existen Beta 

hemolíticos que producen una hemólisis completa y los gamma hemolíticos que no producen 

hemólisis, 

PREGUNTA 6: En referencia a las características generales de los Streptococcus pyogenes. En todas 

los casos señale la opción CORRECTA. Puede haber más de una opción correcta o ninguna. Justifique 

cuando una opción es incorrecta:

a) La proteína M y las exotoxinas SpeA, SpeB y SpeC caracterizan a las cepas más patógenas.

b) Es la causa más frecuente de faringitis en niños y adolescentes de la comunidad.

c) La escarlatina es una manifestación cutánea causada por una exotoxina pirogénica.

d) Las cepas invasivas que producen SpeA pueden causar shock tóxico.

e) Causan infecciones de piel localizadas, sin diseminación a tejidos contiguos.

f) Es sensible a la bacitracina, lo que permite un reconocimiento temprano en cultivo.

g) Causa infecciones piógenas.

PREGUNTA 7: En referencia a las características generales de los Streptococcus pneumoniae. En

todas los casos señale la opción CORRECTA. Puede haber más de una opción correcta o ninguna. 

Justifique cuando una opción es incorrecta:

a) Puede integrar la microbiota normal nasofaríngea e infecta a individuos de la comunidad.

b) Su reservorio exclusivo es el humano.

c) Desarrolla en agar sangre con producción de hemólisis completa.

d) La ausencia de cápsula permite su diseminación sanguínea.

e) Existen solo 2 serotipos capsulares, A y B.