jueves, 3 de mayo de 2018

Extracción de ADN: prácticas de laboratorio


El proceso general de extracción de ADN consiste en: lisis de la pared celular y las membranas plasmáticas; liberación del ADN del núcleo de la célula; y finalmente eliminación de las las proteínas (nucleasas) que puedan degradar el ADN. La lisis se lleva a cabo en una solución salina, con detergentes para desnaturalizar las proteínas estructurales y permitir la liberación de los ácidos nucleicos del núcleo. Posteriormente, las proteínas celulares y lípidos deben ser removidos, mediante la adición de proteasas y centrifugación para precipitar los demás componentes celulares. Finalmente, al añadir alcohol a la muestra, el ADN se suspende y puede ser recogido con una varilla de vidrio

Materiales:
Caja con hielo
pipetas pasteur plástico 1 mL
gradilla plástica
embudos de plástico
tubos falcon 15 mL
papel filtro cualitat 12,5 mn 615
tubos de ensayo pequeños 10 mL
vasos de precipitación 400 mL
varilla de vidrio 25cm
mortero con pistilo
tubos eppendorf 1,5 mL
Reactivos:
10 mL. detergente líquido
1 L. de agua destilada
85 gr. de NaCl
30 mL. de zumo de piña
50 mL. de etanol frío
50 g. de guineo, cebolla u otro vegetal

  • Triturar bien y rápidamente en el mortero aproximadamente 50 gramos de guineo u otra muestra vegetal (por 15-20 segundos).
  • Mezclar la muestra con 100 mL. de agua destilada.
  • Añadir 9 gr. de NaCl y remover la mezcla.
  • Colocar el papel filtro en un embudo dentro de un vaso de precipitación.
  • Colocar la mezcla sobre el papel filtro dentro del embudo para filtrarla.
  • Con la pipeta Pasteur tomar 10 mL. del líquido filtrado y transferir al tubo falcon.
  • En el tubo falcon añadir al filtrado 1mL. de detergente líquido.
  • Añadir 3 mL. de zumo de piña.
  • Tapar el tubo falcon y colocar en el agitador de tubos.
  • Mezclar la solución en el agitador de tubos durante 5 a 10 minutos sin generar espuma.
  • Retirar el tubo del agitador.
  • Usando una pipeta Pasteur transferir 10 mL. de la fase inferior de la mezcla a un tubo de ensayo limpio.
  • Con una pipeta Pasteur ir agregando hasta 5mL. de etanol frío dejando resbalar suavemente el etanol por las paredes del tubo cuidando de no agitar el etanol con la muestra.
  • Dejar reposar unos 15 segundos y observar que en el límite entre el filtrado y el etanol comenzará a aparecer el ADN.
  • En un tubo Eppendorf colocar 1mL de agua destilada.
  • Con una varilla de vidrio rotar suavemente para sacar el ADN y transferir al tubo Eppendorf para disolver el material genético.

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