domingo, 29 de diciembre de 2019

Práctica laboratorio: obtención de penicilina


ADVERTENCIA: LA PENICILINA OBTENIDA EN ESTA PRÁCTICA NO ES DE USO HUMANO. SOLO PARA SU USO EN LABORATORIO

Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de Penicillium y Aspergillus. La fabricación de penicilina es un ejemplo del proceso típico de obtención de antibióticos.
El hongo utilizado industrialmente pertenece al grupo del Penicillium chrysogenum.
Objetivos

  • Obtención de penicilina por inoculación de esporas de Penicillium chrysogenum previamente sembradas en agar sabouraud-glucosa en medio de cultivo líquidoque contiene los nutrientes apropiados para la generación y crecimiento de la biomasa.
  • Comprobar el efecto del antibiótico sobre la cepa Escherichia coli, por el método de los discos de difusión

Materiales y Métodos

Material

Microorganismo: cultivo de Penicillium chrysogenum, obtenido de una naranja
enmohecida y sembrada en agar Sabouraud-glucosa: glucosa: 40.0g, peptona: 10.0g, agar: 15.0g, agua destilada: 1L (pH 5.6).

Material de uso común en el laboratorio: 1 jeringa desechable de 5 ml, agua estéril para inyección, algodón, gasa, asa de siembra, papel indicador del pH (1-7), embudo de vidrio con filtro redondo, mechero Bunsen, erlenmeyer de 500ml.

Método 
Preparación del inóculo: Se debe repicar Penicillium chrysogenum en un tubo de ensayo que contenga agar sabouraud inclinado y dejarlo crecer durante 8 días, mientras este tiempo transcurre se disuelven los componentes del caldo de cultivo (lactosa: 30.0g, glucosa: 10.0g, extracto de levadura: 40.0g, nitrato sódico: 3.0g, dihidrogenofosfato sódico: 0.5g, fenilacetato sódico: 0.3g, sulfato magnésico: 0.25g, sulfato de cinc: una punta de espátula, agua corriente: 1L) en un erlenmeyer de 500ml, se ajusta a pH entre 5.5 y 6, se tapa con algodón y se esteriliza en autoclave a 121°C por 15 minutos. Al día siguiente se procede a la siembra, para ello, se debe limpiar la cabina correctamente, y llevar allí, el medio autoclavado, guantes quirúrgicos, asa de siembra, jeringa desechable de 5 ml, agua estéril para inyección, aspersor con alcohol, gasa y mechero; encender el motor de la cabina y la lámpara germicida y dejar durante 20 minutos, luego apagar la lámpara germicida , encender la lámpara fluorescente, incluir el inóculo y proceder con la inoculación de la siguiente manera: Saque 5ml de agua para inyección con la jeringa y descárguelos sobre el tubo donde se encuentra el inóculo, agite un poco con cuidado de no regar nada y luego adicionar en el erlenmeyer donde se encuentra el medio, realice el mismo procedimiento con 5 ml más y tape con el algodón. Saque todo el material de la cabina, limpie bien con alcohol y gasa, lleve el medio al agitador orbital (shaker) controle el pH cada 2 ó 3 días manteniéndolo a pH 5, durante 10 a 15 días.

Cristalización de la penicilina: Filtrar el caldo de cultivo; tomar el filtrado y ajustar el pH a 2.0 con ácido fosfórico, añadir un volumen igual de éter enfriado en un baño de hielo; luego adicionar unas puntas de espátula de sulfato sódico anhidro, concentrar a vacío hasta reducir a 1/4 el filtrado, añadir un poco de solución de éter disuelto en trietilamina. Filtrar y recoger los cristales obtenidos.

Cortar con perforadora pequeños círculos de papel de filtro e impregnarlos con el filtrado del medio, luego colocarlos en una caja de petri, la cual previamente ha sido sembrada con un microorganismo sensible a la penicilina, que puede ser: Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens. Incubar a 28ºC por 24 horas; al día siguiente se comprueba la actividad de la penicilina por la aparición de halos de inhibición alrededor de los discos de papel.

Preparación de las placas de ensayo


Microorganismo: Escherichia coli.
Material: Agar de ensayo para bacterias: agar MacConkey.
Aparatos: Asas de siembra y mechero Bunsen, espátula de Drigalski, pipetas desechables (1ml estériles), solución de NaCl (0,9%, estéril), tubos de ensayo (estériles)

Procedimiento operativo: Suspender un asa de siembra de las bacterias de ensayo en 2ml de solución de cloruro sódico estéril; pasar 0,1ml de la suspensión bacteriana a la placa con agar de MacConkey; extenderla regularmente con la espátula de Drigalski, secar las placas: dejarlas a 45ºC en una incubadora o estufa abierta, durante 20 minutos. Colocar la tapa, tener listas las placas de ensayo, durante 2 horas.

Comprobación de la penicilina con un ensayo de difusión

Material: Placas de ensayo, discos de papel impregnados de penicilina
Aparatos: Pinzas, mechero Bunsen, estufa y regla graduada
Procedimiento operativo:Colocar los discos de papel con penicilina sobre las placas de ensayo con las pinzas esterilizadas a la llama (3-5 discos), incubar las placas de ensayo a 28ºC, durante 24 horas

Controlar las placas: se comprueba la actividad de la penicilina por la aparición de halos de inhibición alrededor de los discos de papel.

Resultado:El diámetro del halo de inhibición es una medida de la acción (y concentración) antibiótica de la penicilina obtenida. Los halos claros se miden con la regla y los datos obtenidos se reúnen en una tabla. Si se tiene poca práctica, aunque la manipulación haya sido cuidadosa pueden producirse errores, por lo que es recomendable llevar a cabo cada experiencia por triplicado. Por ello, habría que realizar la preparación para la cristalización de la sal de penicilina sólo cuando se haya establecido con certeza la actividad antibiótica con el ensayo con el filtrado de cultivo.

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