sábado, 16 de enero de 2021

Práctica hongos patógenos

 Se inyecta un té de hongos alucinógenos, le crecen hongos en las venas y se salva

Los microorganismos fúngicos presentan una diferencia biológica notable con bacterias y parásitos. La micología médica se enfoca en el estudio de los micromicetos dentro de los cuales las estructuras básicas en el sentido microbiológico nos interesan las levaduras, los filamentos (que se conjunto forma un micelio) y los hongos dimórficos. Los cuales pueden infectar a los humanos, con una prevalencia e incidencia menor en comparación a otros microorganismos, sin embargo, las infecciones micótica se asocian a una mortalidad notablemente más alta.

Los blastoconidios son las estructuras principales de una levadura

Figura 57-2A, Murray, (8ed)

Las hifas representas a los hongos filamentosos,

 Figura 57-2B, Murray, (8ed)

además las levaduras como Candida spp, pueden presentar estructuras semejantes a hifas llamadas pseudohifas y blastoconidios en una misma muestra independientemente de la temperatura fenómeno conocido como pleomorfismo. Por otro lado, podemos encontrar los hongos dimórficos que son aquellos que a temperatura ambiental expresan su forma filamentosa y a temperatura corporal de los humanos (37°C) se observan estructuras levaduriformes. Estos hongos pueden infectar a los humanos, por ejemplo, las levaduras representadas por diversas especies de Candida, o causar las dermatofitosis por hongos filamentosos producida por varios dermatofitos como Trichophyton rubrum. Finalmente, los hongos dimórficos clásicamente representados por Histoplasma capsulatum causante de histoplasmosis. Las infecciones fúngicas se pueden diagnosticar por medio de métodos directos e indirectos, para la micología médica son importantes tinciones como azul de lactofenol y los cultivos como agar Sabouraud, agar Mycosel, agar cromogénico para Candida.

Una vez que el médico ha identificado un cuadro clínico compatible con una infección micótica se enviarán al laboratorio muestras clínicas representativas según el sitio de infección, donde deberán realizarse tinciones y cultivos para la identificación del patógeno fúngico productor de la enfermedad. Una vez identificado el hongo se proceden a pruebas fenotípicas para la confirmación de género y especie, por ejemplo, el tubo germinal que será abordado en esta práctica.

Los hongos pueden tener reproducción sexual, asexual y parasexual como es el caso de Aspergillus.

Objetivos de la práctica

1. Identificar las formas biológicas básicas de un hongo (levaduras y mohos).

2. Conocer las tinciones y medios de cultivos más usados en micología médica.

3. Identificar cepas de las especies de Candida más frecuentes en micología médica.

Alcance

Esta práctica cubre desde el reconocimiento por microscopia de las estructuras fúngicas hasta la asociación con el cultivo de la colonia.

Previo a la realización de la práctica el estudiante deberá:

Revisar la guía de la práctica y recursos que se encuentran en aula virtual.

Conocer la biología de los hongos (capítulo 57, Murray, Microbiología Médica, 8ed).

Diagnostico en micología médica (capítulo 60, Murray, Microbiología Médica, 8ed). 

Aparatos, equipos e instrumentos

Materiales y reactivos

Recursos adicionales

Cultivos micóticos en agar Sabouraud de Candida albicans, Candida krusei 

Cultivos micóticos en agar Sabouraud de Aspergillus spp. y Penicillium spp

Cultivo micótico en agar cromogénico Candida de C. albicans y C. krusei 

Métodos de diagnóstico en microbiología

Revista iberoamericana diagnóstico microscópico micosis pdf

Revista iberoamericana identificación de levaduras

Diagnósticomicrobiológico de lasmicosis y estudios desensibilidad a losantifúngicos

Descripción del procedimiento

SESIÓN 1

Identificar morfología de las colonias de levaduras Candida albicans y Candida krusei (forma, borde, elevación, humedad, etc.).

Tubo germinativo

Permite diferenciar las especies de Candida albicans de las no albicans.

1. Se toma una pequeña porción de la colonia con un asa de platino esterilizada y se siembra en 0,5 ml de suero humano o de conejo.

2. Incuba a 37ºC por 2 horas.

3. Colocar 2 ó 3 gotas de la suspensión en una lámina portaobjeto y cubrir con lámina cubreobjetos y observar al microscopio con objetivo de 40X.

Interpretación: La prueba es positiva al visualizar una estructura elongada que se origina a partir de la levadura.

Figura 1. Tubo germinal positivo

Hidróxido potásico (KOH)

Es el medio de montaje de las muestras clínicas más universalmente aceptado. Permite clarificar todo tipo de muestras clínicas con abundantes células y restos celulares y observar la morfología y la pigmentación fúngica.

1. Se deposita el material a examinar en una placa portaobjetos y se añade una gota de la solución de KOH, se homogeniza la suspensión y se coloca el cubreobjetos.

2. Tras un período de tiempo para permitir la clarificación de la muestra por el KOH, la preparación se examina a 10 x, 40x y 100x.

3. Si fuera necesario, puede calentarse suavemente.

Azul de Lactofenol

El estudio microscópico de los organismos levaduriformes o microorganismos relacionados (género Prototheca) se puede llevar a cabo mediante tinciones, ya sea tinción simple (azul de lactofenol) o tinción de Gram.

1. Se deposita el material a examinar en una placa portaobjetos y se añade una gota de azul de lactofenol, se homogeniza la suspensión y se coloca el cubreobjetos.

2. Después de 2 minutos se examina la muestra a 10x, 40x y 100x.

Microcultivo de hongos filamentosos

Preparación de microcultivos de hongos filamentosos. Fuente

Esta técnica sirve para poder ver los conidios de Aspergillus spp y Penicillium spp. Si intentamos tomar conidios de una colonia crecida en una placa lo normal es que los destrocemos. Con esta técnica los conidios se quedan adheridos al cubreobjeto y de esa manera se pueden observar intactos al microscopio.

SESIÓN 2

1. Correlacionar en agar cromogénico para Candida las diferencias en el color de las colonias.

2. Observación de los resultados de siembra de tubo germinal. 

3. Observación de placas con cultivos de hongos filamentosos y detallar su morfología de colonias.

4. Observación de láminas con extendidos de mohos para la visualización de hifas y cuerpos fructíferos.

Datos a ser registrados y el método de análisis y de presentación de resultados.

Los estudiantes deben complementar los resultados de la práctica con la siguiente información para su discusión en el informe:

Rutas y modos de dispersión de mohos y levaduras estudiadas en el laboratorio.

Patologías asociadas.

Importancia de la adecuada identificación microbiológica para la instauración de una terapia antifúngica adecuada.

Fármacos usados para el tratamiento y su modo de acción en las levaduras y mohos estudiados en el laboratorio.

La presencia del tubo germinativo permite diferenciar C. albicans de otras Candidas. Ojo, el 5% de las C. albicans no desarrollan tubo germinativo. En la fotografía se observan varios tubos germinativos
La presencia del tubo germinativo permite diferenciar C. albicans de otras Candidas. 
Aspergillus spp en tinción con azul de lactofenol
Aspergillus spp en tinción con azul de lactofenol
                                           Penicillium spp en tinción con azul de lactofenol
 Penicillium spp  en tinción con azul de lactofenol

El diagnóstico de las micosis se pueden realizar mediante: 

Observación de fluorescencia al aplicar luz UV (luz de Wood) directamente sobre las lesiones

Ejemplo de pitiriasis versicolor producida por Malassezia furfur. Se tratan con azoles tópicos. Estas lesiones cutáneas hipo/hiperpigmentadas con pérdida de producción de melanina (debido al ácido acelaico producido por la levadura).

Observación microscópica:

    Tinta china sobre muestra de LCR

Cryptococcus neoformans produce una típica micosis oportunista en pacientes inmunodeprimidos. Se diagnostica después de su visualización de sus levaduras capsuladas obtenidas del líquido cefalorraquideo y teñidas con tinta china    

    Blanco de calco-fluor (requiere microscopio de fluorescencia)


Tinción con blanco de calco-fluor de Paracoccidioides brasilensis. Fuente    

    Tinción argéntica

    Tinción con azul de lactofenol

 Penicillium spp  en tinción con azul de lactofenol

Detección de Antígenos específicos

Cultivo en medios selectivos por ejemplo el agar Sabouraud-cloranfenicol, con o sin cicloheximida, un antibiótico que inhibe a los otros microorganismos saprófitos que pudieran crecer en el cultivo. En el caso concreto de Cryptococcus, ve inhibido su crecimiento por la cicloheximida, o lo que es lo mismo, actidiona, por lo que requerirá el agar Sabouraud-cloranfenicol exclusivamente.

Serología  es poco utilizada, tan solo en algunas micosis sistémicas, por ejemplo de Histoplasma

Tipos de micosis






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