Práctica PCR Lamp

                                 

Colonias de P. gingivalis cultivadas en agar sangre. El hemo del medio es oxidado por las bacterias para producir hemina que se acumula en la superficie celular produciendo un pigmento negro característico después de aproximadamente 7 días de incubación anaeróbica. Fuente

Gen HmuY de Porphyromonas gingivalis 

ATCC 33277, NCBI Reference Sequence: NC_010729.1

>NC_010729.1:c610707-610057 Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, complete sequence

ATGAAAAAAATCATTTTCTCCGCACTCTGTGCATTGCCATTGATTGTGTCTCTAACTTCTTGTGGGAAGAAGAAAGACGAGCCGAACCAACCCTCCACACCCGAAGCAGTAACCAAAACCGTAACTATCGATGCTTCGAAATACGAAACGTGGCAGTATTTCTCTTTTTCCAAAGGTGAAGTCGTAAATGTTACCGACTATAAGAACGATTTGAACTGGGACATGGCTCTTCACCGCTATGACGTTCGTCTCAATTGTGGCGAAAGTGGCAAGGGAAAAGGTGGTGCCGTATTCTCCGGCAAGACAGAAATGGATCAGGCTACTTCCGTTCCGACAGACGGATATACCGTAGATGTTCTCGGCCGTATTACAGTCAAGTACGAAATGGGACCTGATGGTCATCAGATGGAATATGAAGAACAGGGCTTCAGCGAAGTGATTACCGGCAAGAAGAACGCACAGGGATTTGCTTCAGGTGGTTGGCTGGAATTCTCTCACGGTCCTGCCGGTCCCACTTACAAGCTGAGCAAAAGAGTCTTCTTCGTTCGTGGTGCTGATGGTAATATTGCCAAAGTGCAGTTCACTGACTATCAGGATGCAGAACTCAAAAAAGGAGTCATCACTTTCACTTATACATACCCCGTTAAATAA

El gen HmuY es una proteína de unión al hierro que es característica de Porphyromonas gingivalis. Por ese motivo, ha sido seleccionada para detectar mediante PCR esta bacteria.

Diagrama de la amplificación isotérmica LAMP. Fuente

Para diseñar primers para una amplificación isoterma usando LAMP la página de NEB.primers nos da el siguiente resultado:

F3_P7 TCCGACAGACGGATATACCG
B3_P7 ACCACGAACGAAGAAGACTC
FIP_P7 TCGCTGAAGCCCTGTTCTTCATTCTCGGCCGTATTACAGTCA
BIP_P7 ACGCACAGGGATTTGCTTCAGGGCTTGTAAGTGGGACCGG

Dado que P. gingivalis es una bacteria anaerobia, podría ser interesante ampliar un fragmento que contenga el gen para utilizarlo como template en las amplificaciones de LAMP

Para ello, escogemos un fragmento del genoma completo de P. gingivalis ATCC 33277 que es la bacteria que tenemos en nuestro laboratorio, ese fragmento va desde la posición 610000 a la 610757

>NC_010729.1:610000-610757 Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, complete sequence

AAAGCAGGCCGATGAGGGCCTGCTTTGTTACTACACTTTTCATATTTCCCTCTTAACTTATTTAACGGGGTATGTATAAGTGAAAGTGATGACTCCTTTTTTGAGTTCTGCATCCTGATAGTCAGTGAACTGCACTTTGGCAATATTACCATCAGCACCACGAACGAAGAAGACTCTTTTGCTCAGCTTGTAAGTGGGACCGGCAGGACCGTGAGAGAATTCCAGCCAACCACCTGAAGCAAATCCCTGTGCGTTCTTCTTGCCGGTAATCACTTCGCTGAAGCCCTGTTCTTCATATTCCATCTGATGACCATCAGGTCCCATTTCGTACTTGACTGTAATACGGCCGAGAACATCTACGGTATATCCGTCTGTCGGAACGGAAGTAGCCTGATCCATTTCTGTCTTGCCGGAGAATACGGCACCACCTTTTCCCTTGCCACTTTCGCCACAATTGAGACGAACGTCATAGCGGTGAAGAGCCATGTCCCAGTTCAAATCGTTCTTATAGTCGGTAACATTTACGACTTCACCTTTGGAAAAAGAGAAATACTGCCACGTTTCGTATTTCGAAGCATCGATAGTTACGGTTTTGGTTACTGCTTCGGGTGTGGAGGGTTGGTTCGGCTCGTCTTTCTTCTTCCCA Protocolo LAMP PCR CAAGAAGTTAGAGACACAATCAATGGCAATGCACAGAGTGCGGAGAAAATGATTTTTTTCATAATTATCTGACCTTACTTTTAATAGGTTTCATCCGGCTGCAAAGTTGAGA

Primer forward: 5´GGGCCTGCTTTGTTACTACAC 3´
Primer reverse: 5´TGCAGCCGGATGAAACCTATT 3´

Protocolo LAMP PCR

Fuente

Nuestra muestra es ADN. Por lo tanto no necesitamos de RNaseOUT, ni Purified RNA sample ni SuperScript Reverse Transcriptase.

Diseña el experimento, la mastermix y cuando tengas el ADN tienes que visualizarlo mediante cromatografía de agarosa.