¿En qué consiste la técnica de la RT-PCR?
El video 1 nos explica breve y gráficamente como es el proceso
Video 1 Coronavirus Test: Real time RT-PCR . Fuente: Animation video
El video 2 es excelente para entender la química debajo de esta técnica y la importancia del Ct a la hora de cuantificar el número de virus o de copias de ADN que tenemos en la muestra
Video 2 Real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) qPCR - PPT Animation. Fuente: Biology with animations
El umbral de ciclos o cycle threshold (Ct) es el número de ciclos en el que la señal fluorescente representa un incremento estadísticamente significativo respecto al nivel basal. El nivel basal se establece con los primeros ciclos, entre el 3 y el 15, en los que los cambios de la señal fluorescente suelen ser mínimos.
El Ct es un valor semicuantitativo inversamente relacionado con la cantidad de ARN o el ADN de la muestra. Un número bajo de Ct está relacionado con mayor carga viral ya que es una relación inversa.
Se dice que es un valor semicuantitativo porque se extrapola a partir de unos controles conocidos. No es un valor que se obtiene de manera directa.
PREGUNTA 1. Discute el porqué existe más mortalidad y riesgo de intubación con menores valores de Ct
PREGUNTA 2. ¿Por qué a medida que hay más ADN molde, el número de ciclos disminuye?
El delta (Δ) Rn se representa en el eje y contra el número de ciclo en el eje x. El ΔRn es la diferencia entre el Rn de cada muestra experimental y el Rn de la línea base. Por lo tanto, solo se trazarán los resultados que estén por encima de la señal de referencia/fondo.
PREGUNTA 3. ¿Debemos de preocuparnos si el Ct de nuestro control negativo (agua) es menor que el que tenemos en nuestras muestras? ¿Y si es mucho mayor el Ct del control negativo que el de las muestras?
En el video 3. Min 3:30 se explican los conceptos de meseta y de fase inicial. Min 4:40 se explica qué significa la eficiencia de la reacción.
Video 3: PCR en tiempo real (qPCR): Conceptos Básicos. Fuente Brandon Ortiz
PREGUNTA 4. En la siguiente gráfica ¿Qué significa la meseta y la fase inicial químicamente?
Fig. Gráfica sigmoidea de una reacción enzimática clásica
PREGUNTA 5. ¿Por qué la eficiencia de la reacción no es exactamente igual a 2? ¿Qué es más eficiente E=1.9 o E=1.95?
Para calcular la eficiencia de una reacción qPCR usamos diluciones seriadas:
Video 3. Assess qPCR Efficiency Using a 10-Fold Serial Dilution. Fuente: Addgene
PREGUNTA 6: ¿Cómo harías una dilución 1/1000 mediante una dilución seriada?
PREGUNTA 7: Esta es una pregunta muy difícil pero no imposible de responder. Después de ver el video 4 ¿Sabrías responder por qué una eficiencia perfecta en dónde cada ciclo las moléculas se doblan (de 2 pasan a 4 a 8 a 16 a 32...) la pendiente de la recta es -3.3 cuando probamos unas diluciones seriadas en base a 10?
Video 4. Using Standard Curve to Estimate DNA Quantity - Forensic Focus #4. Fuente: Thermo Fisher Scientific
PREGUNTA 8: ¿Por qué la eficiencia de la reacción no es exactamente igual a 2? ¿Qué es más eficiente E=1.9 o E=1.95?
Solución video 3.
PREGUNTA 9: ¿Qué función tiene cada uno de los reactivos de la RT-PCR?
Solución video 2 y 3
PREGUNTA 10: ¿Qué razón de ser tiene la sonda de ADN? ¿Qué significa Q y qué R?
Solución videos 2 y 3.
PREGUNTA 11: ¿Por qué además de la muestra siempre ponemos tubos con cantidades de ADN conocida cada vez que hacemos una PCR?
Solución videos 2 y 3.
PROTOCOLO
FastGene® IC Green es un colorante intercalante que solo detecta ADN de doble cadena. Al no inhibir la reacción, el kit FastGene® IC Green puede detectar genes con un valor de CT más bajo, ¡lo que crea una mayor sensibilidad!
Video 5. Amplify Sample with The StepOnePlus™ Real Time System (qPCR step 6). Fuente: Thermo Fisher Scientific
Fig. 1. Pantalla del programa Anydesk que nos permite entrar en la máquina RT-PCR Biorad. En el gráfico se observa la oscilación de temperaturas de las reacciones
Trabajaremos con 6 primers para amplificar genes de las siguientes especies:
ADN:
Primers: Als primer 1: 5´ CTAATGCTGCTACGTATAATT 3´
5´ CCTGAAATTGACATGTAGCA 3´
Paso 1: preparar la master mix
Asegurarnos que todos los reactivos están descongelados y mezclados (vortex)
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Componentes
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X 4.5 |
Concentración final |
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Agua grado PCR |
Hasta 20 ml |
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2X FastGene IC Green |
10 ml |
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1X |
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Primer 1 (mm) |
0.8 ml |
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400 nM |
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Primer 2 (mm) |
0.8 ml |
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400 nM |
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ADN molde |
1 mg de ADN genómico |
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20 ml |
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Paso 2: se preparan las reacciones individuales
Se añade el volumen del master mix al tubo de PCR. A este tubo se le añade el ADN molde. Se mezcla y se cierra el tubo.
Paso 3: correr la PCR
¿ROX es esencial para qPCR?
La respuesta corta es no. No tiene que agregar ROX a su mezcla de qPCR. Sin embargo, agregarlo puede ayudar a reducir las variaciones de los valores fluorescentes en las muestras, lo que finalmente se reflejará en los resultados de la expresión génica.
Otro punto importante es que el uso de ROX depende de la qPCR que esté utilizando. Siempre verifique de antemano si su qPCR es compatible con las mediciones de ROX. Algunas máquinas también prefieren reacciones con ROX alto, mientras que otras prefieren aquellas con ROX bajo.
Si decide utilizar qPCR en su mezcla de reacción, no olvide asegurarse de que la opción para registrar la fluorescencia ROX ya que el tinte pasivo está habilitado. De lo contrario, la máquina no registrará ningún dato para este canal.
Del mismo modo, si no decide usar ROX, no habilite ningún canal que pueda medir ROX. Simplemente, la máquina podría pensar que ROX está presente y registrar el ruido de fondo, lo que puede afectar sus resultados debido a una normalización incorrecta.
Para la máquina que nosotros tenemos no hace falta ROX
Resultado
Fig. 2 muestra
Fig. 3 control negativo (agua)
Para saber más:
Aplicación del valor umbral del número de ciclos (Ct) de PCR en la COVID-19
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