¿Qué es la multiplicidad de infección o MOI?
La multiplicidad de infección o MOI representa la relación entre el número de partículas de virus y el número de células huésped en un medio de infección dado. Un valor de MOI = 1 implica que, en promedio, hay una sola célula huésped para una sola partícula de fago
Para lograr el MOI óptimo debemos de diluir el
cultivo de Salmonella a una concentración de 1× 108 UFC/mL. A
este cultivo de bacterias se le añade una solución de fagos en proporciones de 1; 0.1; 0.01 y 0.001 respectivamente. Se cultivan durante 3 hr a 37ºC.
Posteriormente, se centrifugan los cultivos a
12000 rpm durante 10 min. Esto eliminará las células bacterianas no lisadas. El
sobrenadante se filtra a través de un filtro de 0.22 micras. Eso elimina cualquier
tipo de célula bacteriana dejando pasar a su través a los bacteriófagos. Se
hace titulación de los fagos por el método de doble capa. El experimento se
repite tres veces. Se selecciona la dilución que proporciona la mayor concentración
de fagos como el MOI óptimo (1)
En la figura 1 tenemos los datos publicados para un fago de Salmonella, que emplearé como ejemplo. Los resultados indican que la titulación del fago fue, de izquierda a derecha en la tabla de: 1.2×106 UFP/mL, 3.7× 108 UFP/mL, 2.8× 109 UFP/mL y 3.4× 106 UFP/mL para las diluciones de fagos de MOI 1, 0.1, 0.01 y 0.001. Conclusión, el MOI que favorece que a las 3 horas haya más fagos es MOI = 0.01, es decir, por cada fago hay 100 bacterias disponibles.
Curva de crecimiento en un paso
Este tipo de curva se basa en un método préviamente descrito (2). A un cultivo de Salmonella con una densidad óptica de...... se le añadieron fagos para tener una MOI óptica de 0.01, como se calculó arriba. Se incuba durante 5 min. a 37ºC. Este tiempo es para facilitar que el fago se una a la bacteria. Se centrifuga la mezcla a 12000 rpm durante 10 min. Se elimina el sobrenadante y el pellet se lava dos veces con medio LB. Finalmente el pellet se resuspende en un volumen similar y se incuba a 37ºC con una agitación de 180 rpm. Cada 10 min se toman 100 µl durante tres horas y se diluyen en medio LB y se calcula la titulación de los fagos mediante cultivo en doble agar. El tiempo entre la absorción del fago y el momento en el que ocurre la lisis bacteriana se define como PERIODO DE LATENCIA. Para determinar el número de fagos que salen de una ronda de lisis en Salmonella, tomamos el número medio de fagos finales y se divide por el número inicial de fagos. El experimento se repite tres veces.
1 ¿Están estos protocolos bien establecidos en su campo de estudio? es decir, hay varios laboratorios con experiencia en bacteriófagos empleándolos o es un protocolo que usan estos autores?
2 ¿Por qué un MOI de 1 es menos óptimo que uno de 0.01 en este experimento? ¿Por qué un MOI de 0.001 es menos óptimo que uno de 0.01?
3 ¿Por qué titulan la concentración de fagos cada 10 minutos en el gráfico de la figura 2?
Referencias:
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