Espectrofotometía

La concentración de DNA se puede estimar utilizando un espectrofotómetro de

luz ultravioleta (UV)a una longitud de onda de 260 nm, debido a que las bases púricas y pirimidínicas del ADN tienen la propiedadde absorber la luz UV a esta longitud de onda. Es importante tener en cuenta que, dado el emparejamiento desus bases (puentes de hidrógeno), el ADN bicatenario absorbe menos que el monocatenario. Una unidad dedensidad óptica (DO) a 260 nm equivale a 50 μg/ml de ADN de doble cadena, a 40 μg/ml de ARN y ADN decadena simple, y a 33 μg de oligonucleótidos.

La determinación de la pureza de ADN se establece mediante la lectura de las absorbancias a 260,280 y 230 nm. En las preparaciones de ácidos nucléicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteica.Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de proteínas lleva asobreestimaciones de la concentración de ácidos nucléicos. La concentración de proteína puede ser evaluada a una absorbancia de 280 nm, por lo que es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A260 nm/A280 sea menor que el esperado para ácidos nucléicos puros.

Una muestra pura debe presentar un radio de absorbancia a 260/280 nm que exceda el valor de 1.75 para propósitos analíticos (para ADN de doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 ≥ 1.8). Si la muestra es impura deberán repetirse extracciones con fenol para eliminar impurezas.

El Nanodrop es un espectrofotómetro habitual en los laboratorios que trastean con ADN