Tratan
de establecer si los biofilms de Neisseria
meningitidis crecidos,
en un aparato de cultivo continuo “sorbarod” o en cultivo
estático, podrían mimetizar a los biofilms que se forman y
colonizan el epitelio humano.
Se
utilizó un microarray de dos colores en donde se marcó con Cy3 el
DNA genómico de una cepa tipo de N.
meningitidis.
Por
resultados previos los autores sospechan que tiene que haber una
represión de los genes responsables de la producción de los
azucares (LOS) que rodean la membrana externa de la célula para que
se forme el biofilm.
Trabajan
con dos cepas, una cepa tipo y una cepa mutante para la formación de
LOS y las hacen crecer en dos tipos de cultivos, con flujo de
nutrientes y en cultivo estático. Comprueban que se forman biofilms
en estos cultivos por tinción violeta cristal y cuantificando con un
espectrofotómetro. De esta manera se igualan las muestras.
Posteriormente se extrae mediante un kit comercial el RNA. Las
muestras de RNA se cuantificaron con el Nanodrop y se confirmaron
mediante electroforesis. Se marcó el RNA y el DNA. El microarray se
hizo siguiendo el protocolo disponible en la página del grupo de
Microarrays bacterianos ( BµG@S)
http://bugs.sgul.ac.uk/bugsbase/tabs/array.php?design_id=24&action=designs
Cada
array se co-hibridó con una de las muestras problema marcadas con
Cy5 y con el DNA genómico de la cepa tipo (control universal). Los
microarrays se escanearon con GenePix-4000B y se analizaron con
GenePix Pro 6.0. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con
Genespring GX 7.3. Los ratios log-transformados fueron normalizados
por la técnica de LOWESS usando un 20% de los datos para suavizar.
Los
datos recolectados a partir de 5 réplicas del mismo experimento se
trataron de la siguiente forma: los ratios log-transformados de las
muestras recolectadas a las 48h renormalizaron a el valor de la
mediana que se calculó de las muestras a tiempo 0, lo que dió un un
ratio T48/T0. Los genes expresados diferencialmente se seleccionaron
usando un test t-Student con un valor p = 0.01. Los resultados del
microarray se validaron utilizando una RT-PCR cuantitativa.
El
objetivo de este estudio era hacer un análisis transcripcional de
los genes de N. meningitidis en biofilms ya que la bacteria se
encuentra en la cavidad nasofaringea como comensal en este estado.
Observaron que como sospechaban los genes asociados a la formación
de cápsula estaban más reprimidos en los biofilms de la cepa
salvaje. El resultado estrella fue observar que los genes que
codifican para proteínas que se encuentran en las vesículas de
membrana externa (son unas vesículas de entre 50 y 200 nm que se
liberan de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas al
medio) están sobrexpresadas en los biofilms maduros. Esto es un dato
muy interesante porque algunas de estas proteínas son actualmente
consideradas los constituyentes más prometedores de las vacunas
propuestas para la enfermedad causada por los meningococos serogrupo
B.
Referencia:
Meningococcal biofilm growth on an abiotic surface - a model for epithelial colonization?
O'Dwyer CA, Li MS, Langford PR, Kroll JS. Microbiology. 2009 Jun;155(Pt 6):1940-52. 2009
Esta publicación se ha realizado con un microarray generado por el grupo BµG@S, que es un servicio del The Bacterial Microarray Group at St George's (BµG@S) facility.
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