Las bacterias son pequeñas células procariotas, cuya longitud es de 0.2 a 10 μm.
La clasificación preliminar de bacterias se basa en la forma (cocos, bacilo y espirilos), disposición (pares, cadenas o grupos), propiedades específicas de crecimiento (aerobias o anaerobias, anaerobios facultativos)
resistente al ácido. Los micoplasmas son bacterias que no tienen pared celular y, por lo tanto, no se tiñen con Gram. Algunos tipos de bacterias pueden generar esporas.
Usando la tinción de Schaeffer-Fulton que contiene verde malaquita, se observan las endosporas de color verde y más pequeñas que las células activas. Fuente
El cultivo de bacterias a partir de muestras tomadas de infecciones se logra generalmente con la inoculación directa en medios de cultivo, inicialmente se realiza un inóculo primario y mediante estrías secuenciales se obtienen colonias bacterianas individuales
Técnicas básicas de Microbiología: Aislamiento y siembra en estría de una bacteria. Fuente: Área Microbiología Universidad de Salamanca
En la identificación bacteriana la morfología colonial incluye lo siguiente: Tamaño de la colonia
(generalmente medido en milímetros o descrito en términos relativos como puntual, pequeño,
mediano, grande), coloración, forma de la colonia (incluye, elevación y borde de la colonia,
aspecto de la superficie de la colonia (brillante, opaco, seco y transparente).
Además, cada bacteria tiene un metabolismo diferente lo que ocasiona diferentes cambios en
los medios de agar como resultado del metabolismo (hemólisis, cambios de pH, orificios, etc.),
cabe mencionar que ciertas bacterias producen olores distintos que pueden ayudar en la
identificación preliminar.
La práctica se realizará en dos sesiones
Se establecerá un cultivo líquido mixto para teñir con GRAM + Y GRAM -
Se crecerá Salmonella sp. y Escherichia coli en una caja bipetri
Streptococcus viridans y Staphylococcus aureus se crecerán en agar sangre.
SESIÓN 1
1. De manera individual inocular en medio sólido en caja Petri a partir del caldo de
cultivo.
1. De manera individual inocular en medio sólido en caja Petri a partir del caldo de
cultivo.
Se sembrará una mezcla de bacterias Gram +/- en una placa de agar nutritivo y se sembrarán Salmonella sp. y Escherichia coli, Streptococcus viridans y Staphylococcus aureus en una placa del medio EMB.
a. Esterilizar el asa redonda al rojo vivo en la llama azul del mechero Bunsen.
Todas las transferencias y siembras se deben ejecutar a partir de este proceso
y permanecer cerca de la zona de esterilidad del mechero.
b. Antes y después de abrir un tubo se debe flamear el borde o la boca rosca. Para
disminuir contaminaciones, se recomienda sujetar la tapa con el dedo meñique,
no dejarla sobre el mesón de trabajo.
c. Enfriar el asa en las paredes internas del tubo previo a tomar la muestra líquida.
Tener precaución de no producir aerosoles.
d. Tomar una muestra homogénea, observar que se forme una película de líquido
en la cabeza del asa redonda.
e. Flamear por última vez la boca del tubo y tapar.
f. Realizar el inóculo primario sobre el borde del agar contenido en la caja Petri y
proceder con la siembra semicuantitativa por la técnica de agotamiento.
g. Finalmente esterilizar el asa redonda, tapar la caja Petri y rotular sobre la base
de la caja.
2. Por equipo de trabajo, inocular en medios en tubo a partir de un medio sólido en
caja Petri
a. Colocar la caja Petri cerca del mechero Bunsen con la tapa hacia abajo.
b. Esterilizar el asa recta al rojo vivo en la llama azul del mechero Bunsen.
c. Destapar la caja Petri y enfriar el asa recta en una zona del agar libre de
crecimiento. Tener precaución de no producir aerosoles.
d. Tomar una muestra a partir de una colonia claramente aislada y definida. Tapar
la caja en seguida.
e. Destapar el tubo donde se inoculará. Sujetar la tapa con el dedo meñique.
f. Flamear la boca del tubo de vidrio no inoculado.
a. Esterilizar el asa redonda al rojo vivo en la llama azul del mechero Bunsen.
Todas las transferencias y siembras se deben ejecutar a partir de este proceso
y permanecer cerca de la zona de esterilidad del mechero.
b. Antes y después de abrir un tubo se debe flamear el borde o la boca rosca. Para
disminuir contaminaciones, se recomienda sujetar la tapa con el dedo meñique,
no dejarla sobre el mesón de trabajo.
c. Enfriar el asa en las paredes internas del tubo previo a tomar la muestra líquida.
Tener precaución de no producir aerosoles.
d. Tomar una muestra homogénea, observar que se forme una película de líquido
en la cabeza del asa redonda.
e. Flamear por última vez la boca del tubo y tapar.
f. Realizar el inóculo primario sobre el borde del agar contenido en la caja Petri y
proceder con la siembra semicuantitativa por la técnica de agotamiento.
g. Finalmente esterilizar el asa redonda, tapar la caja Petri y rotular sobre la base
de la caja.
2. Por equipo de trabajo, inocular en medios en tubo a partir de un medio sólido en
caja Petri
a. Colocar la caja Petri cerca del mechero Bunsen con la tapa hacia abajo.
b. Esterilizar el asa recta al rojo vivo en la llama azul del mechero Bunsen.
c. Destapar la caja Petri y enfriar el asa recta en una zona del agar libre de
crecimiento. Tener precaución de no producir aerosoles.
d. Tomar una muestra a partir de una colonia claramente aislada y definida. Tapar
la caja en seguida.
e. Destapar el tubo donde se inoculará. Sujetar la tapa con el dedo meñique.
f. Flamear la boca del tubo de vidrio no inoculado.
Tubos TSI
g. En el tubo con medio inclinado o en bisel “slant” (TSI), insertar el asa recta hasta
3 mm antes de llegar al fondo, retirar lentamente y estriar en la superficie de lado
a lado.
h. Mientras que en el tubo con medio semisólido (SIM) insertar el asa recta de3 mm antes de llegar al fondo, retirar lentamente y estriar en la superficie de lado
a lado.
manera vertical y precisa hasta 3 mm antes de llegar al fondo, retirar lentamente
i. Flamear por última vez la boca del tubo y tapar.
j. Finalmente esterilizar el asa recta, y rotular el tubo.
Inocular en medio líquido a partir del caldo de cultivo (realizar 1 de las 3 técnicas):
Inoculación con asa redonda:
a. Destapar y flamear el tubo de donde se tomará la muestra.
b. Tomar la muestra con el asa redonda previamente esterilizada, flamear y tapar
enseguida el tubo.
c. Abrir el tubo no inoculado y flamear la boca, inclinarlo y depositar suavemente el
líquido contenido en la cabeza del asa redonda contra la superficie del medio.
d. Flamear y tapar enseguida el tubo inoculado, rotular.
Inocular con hisopo:
a. Introducir el hisopo en el medio con muestra bacteriana y agitar, llevar el hisopo
al tubo no inoculado y rotar.
b. Para desechar el hisopo en cortopunzantes previamente flamear la parte
contaminada del hisopo.
Inocular con pipeta:
a. Aspirar con la pipeta Pasteur un pequeño volumen de la muestra bacteriana
previamente homogenizada y transferir inmediatamente al tubo no inoculado,
mezclar nuevamente.
b. Desechar la pipeta en el recipiente con hipoclorito de sodio al 0.5%. Flamear y
tapar enseguida el tubo inoculado, rotular.
SESIÓN 2
1. Seleccionar 1 caja petri (de las inoculadas individualmente) por equipo de trabajo y
realizar tinción Gram de 1 colonia aislada.
2 Completar la tabla a continuación en relación con las características morfológicas y
microscópicas de las colonias bacterianas aisladas
PREGUNTAS:
PREGUNTA 1: Siembro por agotamiento en estrías a partir de una colonia. Esta colonia tenía 2.5 x 10E9 bacterias. En el segundo estriado, con el asa tomo la 1/500 parte de estas bacterias. En el tercer estriado tomo la 1/100 parte de las bacterias, en el cuarto estriado 1/10, en el quinto 1/20 y el sexto y último estriado la 1/50 parte de las bacterias. ¿Cuántas bacterias tendré en el asa en el sexto estriado?
Resultado: 1/500 x 1/100 x 1/10 x 1/20 x 1/50 = 0,000000002
2.5 x 109 x 1/500 x 1/100 x 1/10 x 1/20 x 1/50 = 5 colonias
Para saber más:
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