jueves, 28 de febrero de 2019

Práctica de transformación bacteriana


La transformación bacteriana es cuando una bacteria adquiere ADN de otra fuente que no sea la de sus progenitores. Fuente
Objetivos de la práctica

Clonar el gen GAPDH humano en células competentes eficientes de Escherichia coli. 
Confirmar la eficiencia de la transformación mediante PCR del gen GAPDH en las bacterias transformadas.

Esta práctica de laboratorio incluirá la extracción de sangre total periférica, extracción y cuantificación de ADN, amplificación por PCR del gen GAPDH y visualización del producto de la PCR en gel de electroforesis. El producto de PCR, gen GAPDH, se clonará en las células competentes de Escherichia coli mediante transformación bacteriana. Finalmente, se evaluará la eficiencia de la transformación mediante PCR del gen GAPDH y observación del amplicón mediante electroforesis en gel.

Aparatos, equipos e instrumentos

Sesión 1: Extracción de ADN

Aparatos, equipos e instrumentos
Cantidad
Requisitos técnicos
Vórtex
1

Juegos de micropipetas de alta precisión
3
(10, 20, 200, 1000 ul) calibradas
Centrífuga
1
calibrada
Termobloque
1
A 37°C
Fluorómetro Qubit
1


Sesión 2: PCR y Electroforesis

Aparatos, equipos e instrumentos
Cantidad
Requisitos técnicos
Vórtex
1

Juegos de micropipetas (10, 200, 1000 ul)
3
calibradas
Centrífuga
1
calibrada
Microcentrífuga
1
calibrada
Termociclador
1

Cámara de Electroforesis
1

Fuente de Poder
1

Balanza analítica
1
calibrada
Fotodocumentador
1


Sesión 3: Transformación bacteriana:

Aparatos, equipos e instrumentos
Cantidad
Requisitos técnicos
Vórtex
1

Juegos de micropipetas de alta precisión
3
(10, 20, 200, 1000 ul) calibradas
Centrífuga
1
calibrada
Termobloque
1
A 42°C y 70°C
Incubadora con agitación
1
A 37°C
Incubadora
1
A 37°C

Materiales y reactivos

Sesión 1: Extracción de ADN

Materiales
Cantidad
Especificaciones
Tubos eppendorf
20 unidades c/u
0,2-0,5-1 ml
Gradillas
3 unidades
Para tubos eppendorf
Guantes de látex
30 pares
Talla M y L
Guardianes
3 unidades

Puntas de micropipeta
1 rack c/u
0,2-0,5-1 ml
Jeringuilla/ vacuntainer
6
5 ml
Tubos EDTA
6
5 ml
Toallas de papel
30

Torundas de algodon
30

Torniquete
6

Reactivos
Cantidad
Especificaciones
Agua MiliQ
100 ml

Etanol frío
100 ml
99%
Isopropanol
100 ml
99%
Reactivo Purelink Genomic DNA kit Invitrogen

7 Reacciones

Sesión 2: PCR y Electroforesis

Materiales
Cantidad
Especificaciones
Tubos eppendorf
20 unidades c/u
0,2-0,5-1 ml
Gradillas
3 unidades
Para tubos eppendorf
Guantes de látex
30 pares
Talla M y L
Guardianes
3 unidades

Puntas de micropipeta
1 rack c/u
0,2-0,5-1 ml
Toallas de papel
30

Reactivos
Cantidad
Especificaciones
Agua MiliQ
100 ml
estéril
dNTPs
20 ul
99%
Taq polimerasa
2 ul
5u/ul
Buffer o tampón de reacción
30 ul
10X
Primer
6 ul c/u
10 uM c/u
ADN diana
6 ul

MgCl2
10 ul
50mM
SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain
10 ul
frio
Agarosa
2 gramos
polvo
Buffer de Carga para Ácidos Nucleicos
50 ul
Frio
Buffer TBE 1X
1 L

 Sesión 3: Transformación bacteriana:

Materiales
Cantidad
Especificaciones
Tubos eppendorf
20 unidades c/u
0,2-0,5-1 ml
Mecheros y fósforos
6

Gradillas
3 unidades
Para tubos eppendorf
Guantes de látex
30 pares
Talla M y L
Guardianes
3 unidades

Puntas de micropipeta
1 rack c/u
0,2-0,5-1 ml
Pipeta de 1 a 5 ml estéril
10

Pera
6

Pipetas de vidrio estériles
12

Tubos de ensayo estériles
12

Capuchón para pipetas de vidrio estériles
12

Reactivos
Cantidad
Especificaciones
Agua MiliQ
100 ml
estéril
Buffer de Reacción 2X
80 uL

Producto de PCR a clonar
10 uL

Enzima que genera extremos romos
10 uL

Células competentes de E. coli
1 ml

Vector de clonación pJET 1.2/blunt (50ng/uL)
10 uL

T4 DNA Ligasa
10 uL

Medio LB o SOC
12 mL

Placas Petri con medio LB o SOC
8


Sesiones 4 y 5: Comprobación de la Transformación Bacteriana

Se utilizarán los equipos, materiales y reactivos detallados en la sesión 1 y 2 de esta práctica, correspondientes a la extracción de ADN, la PCR del gen GAPDH y la electroforesis del producto de PCR.

Descripción del procedimiento

Sesión 1: Extracción de ADN

Refiérase a la práctica 3 de esta guía.

Sesión 2: PCR y Electroforesis

Refiérase a las prácticas 5 y 6 de esta guía.

Sesión 3: Transformación Bacteriana

Ligación del vector y el gen a clonar

Ensamble la reacción en hielo de acuerdo a la siguiente tabla:
Reactivo
Volumen
Buffer de Reacción 2X
10 uL
Producto de PCR a clonar
1 uL
Agua grado PCR o miliQ
6 uL
Enzima que genera extremos romos de DNA
1 uL
Volumen Total de la Blunting Reaction
18 uL
Coloque el tubo con la mezcla blunting reaction en el vórtex durante 5 seg y centrifugue durante 5 seg más.

Incube el tubo con la mezcla blunting reaction a 70°C durante 5 minutos y luego ponga a enfriar en hielo.

Añada a la blunting reaction 1 ul del vector de clonación pJET 1.2/blunt (50ng/uL) y 1 uL de la T4 DNA Ligasa.

Coloque el tubo con la nueva mezcla en el vórtex durante 5 seg y centrifugue durante 5 segundos.

Incube el tubo con la mezcla de ligación a temperatura ambiente durante 5 minutos.

Use esta mezcla para la transformación,

Transformación bacteriana

Descongele las células competentes de E. coli en hielo

Agregue 3 μl de la mezcla del paso anterior a una alícuota de células de 50μL en un tubo eppendorf de 0,2 mL.

Incube el tubo en hielo durante 30 minutos.

Genere un shock de calor al colocando el tubo en el termobloque a 42°C durante 30 segundos.

Luego coloque el tubo en hielo durante 2 minutos.

Añada 1 ml de medio LB o SOC precalentado a 37°C

Incube a 37 ° C, con una agitación de 200 rpm, durante 1 hora para el crecimiento bacteriano.

Distribuya las diluciones 1:10 y 1: 100 de los cultivos de crecimiento en placas Petri con el medio de cultivo.

Incube a 37 ° C durante 12-16 horas.

Inspeccione las placas para observar presencia de colonias transformadas.

Sesión 4: Comprobación de la Transformación Bacteriana: Extracción de ADN

Realice la extracción de ADN de las colonias de bacterias transformantes de acuerdo al método de columnas detallado en la práctica 3 de esta guía.

Sesión 5: Comprobación de la Transformación Bacteriana: PCR y Electroforesis

Realice nuevamente la PCR del gen GAPDH y electroforesis del producto de PCR como se ha mencionado anteriormente en este procedimiento.