Purificación fagos por ultracentrifugación

 

Protocolo para purificar fagos con gradiente de sucrosa pincha aquí

1    Centrifugar el lisado en la centrífuga Sorvall Lynx 4000 a 5.000 rpm, 5 min, 4ºC. Deseche el precipitado.

2     Agregue Triton X-100 a los sobrenadantes del lisado para obtener una concentración final del 1 % (de un stock del 10 ó 20 %). 

3     Centrifugar el lisado en la ultracentrífuga Sorvall WX Ultra Series a 17 000 rpm, 50 min, 4 ºC. Deseche los sobrenadantes. 

4     Resuspender los sedimentos de virus con un pequeño volumen de Tris-HCl 50 mM, pH 7,8 *Aproximadamente 1,0 mL por 100 mL de lisado 

5     Coloque la suspensión de virus en capas sobre gradientes de sacarosa lineales de 100-400 mg/ml (10-40 %) equilibrados con Tris-HCl 50 mM fabricados en tubos de polipropileno (capa de aproximadamente 3-4 ml por gradiente). 

*Para hacer reservas de sacarosa, agregue 10-40% de sacarosa a Tris-HCl y autoclave. 

6     Centrifugar los gradientes en la ultracentrífuga a 20.000 rpm, 20 min, 4ºC. El virus será la banda principal entre 1/2 y 2/3 de profundidad en el gradiente. 1 

7     Retire las bandas de virus de los gradientes con agujas estériles y transfiéralas a tubos de centrífuga de polipropileno de 30 ml. Dividir el virus de 3 gradientes entre dos tubos. Diluya lentamente el virus al volumen del tubo con Tris-HCl 50 mM. Centrifugar los tubos en la ultracentrífuga a 27.000 rpm, 3 horas, 4ºC. Deseche los sobrenadantes. 

8     Resuspender los sedimentos de virus con un pequeño volumen de Tris-HCl 50 mM. Conservar el virus a 4ºC. No congelar. Se recomienda la esterilización por filtración utilizando un filtro de acetato de celulosa de 0,45 um.

Plasmid DNA Extraction (CsCI Isolation). Fuente: Abnova

Phage isolation and concentration by cesium chloride (CsCl) gradient.