1. El primer paso es añadir 2 ml del buffer EQ1 en las columnas para que tengan el ambiente iónico adecuado para unir el ADN. Se le da un spin en la centrífuga para que baje el buffer.
Buffer EQ1 0.1 M Acetato sódico pH 5.0
0.6 M NaCl
0.15% (v/v) Triton® X-100
2. Obtenemos los lisados de las bacterias y los fagos que se encuentran en ellos lavando con PBS una placa Petri o si de un cultivo líquido. Determinamos con una pipeta el volume exacto.
3. Dependiendo del volumen que tengamos del lisado añadimos un volumen de buffer X1 que va entre 30 µL de buffer X1 a 10 mL. Incubamos a 37º C durante 30 min para darle tiempo a la RNasa A y a la DNasa I a degradar el ARN y el ADN respectivamente. El EDTA de este buffer capta los iones metálicos y de esa forma inactiva las metaloproteinasas que podrían estar degradando la cápside proteica de los fagos.
Buffer X1 = 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
300 mM NaCl
10 mM EDTA
20 mg/mL RNasa A,
6 mg/mL DNasa I
4. Al tubo con la digestion de las nucleasas añadimos 2 mL de buffer X2 a 4ºC e incubo en hielo durante una hora. La alta concentración de sal y el PEG ayudan a condensar los ácidos nucleicos, además, junto con el frio inactivan a las DNasas y RNasas.
Buffer X2 = 3 M NaCl
30% (w/v) polietileneglicol (PEG) 6000
5. Para recolectar a los fagos intactos, centrifugamos durante 10 minutes a velocidad máxima (más de 10,000 x g). Desechamos el sobrenadante que contiene los restos de lípidos, proteínas, ADN y ARN de las bacterias lisadas.
6. Resuspendemos el pellet con los fagos en 1 ml de buffer X3 con una pipeta. El EDTA impide la degradación de metaloproteinasas. El tris mantiene un pH fisiológico
Buffer X3 = 100 mM Tris-HCl (pH 8.0)
25 mM EDTA
7. Añadimos 1 mL de buffer X4 a la suspensión de fagos. Mezclamos concienzudamente invirtiendo el tubo varias veces e incubando por 10 min a 70 ºC para disgregar la cápside proteica y liberar los ácidos nucleicos de los fagos.
Buffer X4 = 4% (w/v) SDS
8. Añadimos 1 mL de buffer X5 al tubo con los fagos lisados. Mezclamos concienzudamente invirtiendo el tupo y centrifugamos durante10 minutes a temperatura ambiente y 13,000 x g. Los ácidos nucleicos del fago habrán condensado por la acción del acetato potásico 3M, mientras que los restos proteicos de los fagos, o los fagos que todavía están intactos se van a ir al pellet. Tomamos el sobrenadante evitando el pellet y lo aplicamos sobre las columnas que han sido previamente equilibradas en el paso 1. Dejamos que el lisado penetre en la resina de la columna por gravedad. Los ácidos nucleicos se quedarán pegados a la resina
Buffer X5 = 3.0 M acetato potásico (ajustar el pH 5.5 con ácido acético)
9. Lavamos la columna para descartar todo aquello que no sean los ácidos nucleicos adheridos a la matriz de la columna. Lavamos 2 x 2.5 mL con el buffer W8 (Wash Buffer).
Buffer W8 = 0.1 M Acetato sódico (pH 5.0 ajustado con ácido acético)
(wash buffer) 825 mM NaCl
10. Eluímos el ADN del fago mediante 0.9 mL de buffer X6. Es el alto contenido en NaCl la que hace que el ADN ya no se adhiera a la matriz de la columna. A este volume se le añade 630 ul de of isopropanol (0.7 del volume previo) a temperatura ambiente. Este paso hace que el ADN se deshidrate y se compacte.
Buffer X6 = 0.1 M acetato sódico (a pH 5.0 ajustado con ácido acético)
1,5 M NaCl
11. Centrifugamos el ADN a máxima velocidad 13,000 x g a 4 ºC durante 30 min. Como el ADN de los fagos es pegajoso se pueden fijar a la pared del tubo de centrífuga si el rotor es de ángulo fijo. Por eso es mejor un rotor basculane tipo (i.e. HB-4 or HB-6 para centrífugas Sorval). Como alternativa se pueden usar tubos Corex siliconizados con dimetildiclorosilano.
12. Después de la centrifugación se lava el pellet de ADN con 80% de etanol (así se eliminan sales) y se seca al aire. El ADN se resuspende en agua, TE o 10 mM Tris buffer (pH 8.0).
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