Cómo detectar Porphyromonas gingivalis

La Diversidad de cepas en Porphyromonas gingivalis han demostrado que las cepas de P. gingivalis varían en su virulencia (destrucción y muerte de tejidos blandos) en modelos animales, y algunas cepas se clasifican como virulentas, por ejemplo, las cepas W83, W50, ATCC 49417 y A7A1, y otras se clasifican como avirulento, por ejemplo, cepas 381, 33277 y 23A4

Virulentas

ATCC 49417 9 publicaciones
ATCC A7A1 6 publicaciones
ATCC W83 73 publicaciones
ATCC W50 45 publicaciones. Cepa "wild type"

Avirulentas

ATCC 33277 342 publicaciones. Se usa como cepa tipo. En esta publicación se analizó el diferente perfil genético en biofilms versus células plantónicas.

ATCC 381 119 publicaciones

Colonias de P. gingivalis cultivadas en agar sangre. El hemo del medio es oxidado por las bacterias para producir hemina que se acumula en la superficie celular produciendo un pigmento negro característico después de aproximadamente 7 días de incubación anaeróbica. Fuente

Gen HmuY de Porphyromonas gingivalis 

ATCC 33277, NCBI Reference Sequence: NC_010729.1

>NC_010729.1:c610707-610057 Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, complete sequence

ATGAAAAAAATCATTTTCTCCGCACTCTGTGCATTGCCATTGATTGTGTCTCTAACTTCTTGTGGGAAGAAGAAAGACGAGCCGAACCAACCCTCCACACCCGAAGCAGTAACCAAAACCGTAACTATCGATGCTTCGAAATACGAAACGTGGCAGTATTTCTCTTTTTCCAAAGGTGAAGTCGTAAATGTTACCGACTATAAGAACGATTTGAACTGGGACATGGCTCTTCACCGCTATGACGTTCGTCTCAATTGTGGCGAAAGTGGCAAGGGAAAAGGTGGTGCCGTATTCTCCGGCAAGACAGAAATGGATCAGGCTACTTCCGTTCCGACAGACGGATATACCGTAGATGTTCTCGGCCGTATTACAGTCAAGTACGAAATGGGACCTGATGGTCATCAGATGGAATATGAAGAACAGGGCTTCAGCGAAGTGATTACCGGCAAGAAGAACGCACAGGGATTTGCTTCAGGTGGTTGGCTGGAATTCTCTCACGGTCCTGCCGGTCCCACTTACAAGCTGAGCAAAAGAGTCTTCTTCGTTCGTGGTGCTGATGGTAATATTGCCAAAGTGCAGTTCACTGACTATCAGGATGCAGAACTCAAAAAAGGAGTCATCACTTTCACTTATACATACCCCGTTAAATAA

El gen HmuY es una proteína de unión al hierro que es característica de Porphyromonas gingivalis. Por ese motivo, ha sido seleccionada para detectar mediante PCR esta bacteria.

Diagrama de la amplificación isotérmica LAMP. Fuente

Para diseñar primers para una amplificación isoterma usando LAMP la página de NEB.primers nos da el siguiente resultado:

F3_P7 TCCGACAGACGGATATACCG
B3_P7 ACCACGAACGAAGAAGACTC
FIP_P7 TCGCTGAAGCCCTGTTCTTCATTCTCGGCCGTATTACAGTCA
BIP_P7 ACGCACAGGGATTTGCTTCAGGGCTTGTAAGTGGGACCGG

Dado que P. gingivalis es una bacteria anaerobia, podría ser interesante ampliar un fragmento que contenga el gen para utilizarlo como template en las amplificaciones de LAMP

Para ello, escogemos un fragmento del genoma completo de P. gingivalis ATCC 33277 que es la bacteria que tenemos en nuestro laboratorio, ese fragmento va desde la posición 610000 a la 610757

>NC_010729.1:610000-610757 Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, complete sequence

AAAGCAGGCCGATGAGGGCCTGCTTTGTTACTACACTTTTCATATTTCCCTCTTAACTTATTTAACGGGGTATGTATAAGTGAAAGTGATGACTCCTTTTTTGAGTTCTGCATCCTGATAGTCAGTGAACTGCACTTTGGCAATATTACCATCAGCACCACGAACGAAGAAGACTCTTTTGCTCAGCTTGTAAGTGGGACCGGCAGGACCGTGAGAGAATTCCAGCCAACCACCTGAAGCAAATCCCTGTGCGTTCTTCTTGCCGGTAATCACTTCGCTGAAGCCCTGTTCTTCATATTCCATCTGATGACCATCAGGTCCCATTTCGTACTTGACTGTAATACGGCCGAGAACATCTACGGTATATCCGTCTGTCGGAACGGAAGTAGCCTGATCCATTTCTGTCTTGCCGGAGAATACGGCACCACCTTTTCCCTTGCCACTTTCGCCACAATTGAGACGAACGTCATAGCGGTGAAGAGCCATGTCCCAGTTCAAATCGTTCTTATAGTCGGTAACATTTACGACTTCACCTTTGGAAAAAGAGAAATACTGCCACGTTTCGTATTTCGAAGCATCGATAGTTACGGTTTTGGTTACTGCTTCGGGTGTGGAGGGTTGGTTCGGCTCGTCTTTCTTCTTCCCACAAGAAGTTAGAGACACAATCAATGGCAATGCACAGAGTGCGGAGAAAATGATTTTTTTCATAATTATCTGACCTTACTTTTAATAGGTTTCATCCGGCTGCAAAGTTGAGA

Primer forward: 5´GGGCCTGCTTTGTTACTACAC 3´
Primer reverse: 5´TGCAGCCGGATGAAACCTATT 3´

Tomar muestras de P. gingivalis con puntas de papel

En este artículo describen el procedimiento. 

Puntas de papel para toma de muestras. Fuente

Como sembrar y cultivar anaerobiamente. Fuente

Las colonias obtenidas se pueden identificar por Viteck–2 usando las tarjetas ANC. También se puede utilizar el Maldi-TOF.

Amplificar el gen mediante LAMP

La reacción LAMP para la detección de P. gingivalis se llevó a cabo usando una amplificación de ADN Loopamp kit (Eiken Chemical Co., Ltd., Tochigi, Japón) en 25 ul volumen. La mezcla de reacción contenía 40 pmol cada uno de FIP y BIP, 5 pmol de cada uno de los cebadores F3 y B3c,

2 ul de ADN de la bacteria, 1 ul de Bst ADN polimerasa y 12,5 ul de mezcla de reacción preparada en el kit. La mezcla de reacción se incubó a 60, 62, 64 o 66ºC durante 30 o 60 min. Después de la incubación, la reacción se terminó calentando la mezcla de reacción a 80ºC por 2 minutos

Detección a simple vista por SYBR Green

Para detección a simple vista, se añadió a la mezcla de reacción 1,0 ul de SYBR Green I diluido  10^-1 o 10^-3  (Takara Bio Inc., Otsu, Japón). El cambio de color se observa a simple vista. La inspección del tubo con SYBR Green I diluido 10^-3  se realizó bajo luz UV (longitud de onda de 302 nm). El cambio de color de las muestras con SYBR Green diluidas  10^-1 se ven bajo luz natural.

Inspección a simple vista de las reacciones positivas (Pg 20 y Pg200) y negativas (Pg -) de la amplificación LAMP. a) El color naranja original de SYBR green del control negativo se torna en verde en el control positivo. b) la fluorescencia de la unión al ADN al  SYBR green I se detectó visualmente bajo luz ultravioleta. La detección límite de ambas inspecciones a simple vista con SYBR green I fue inferior a 20 células (Pg20). c) La reacción LAMP también se inspeccionó a través de blanco

turbidez del tubo causada por el pirofosfato de magnesio, un subproducto de LAMP. El límite de detección de la turbidez blanca fue a 200 células (Pg200). Fuente

Reactivos

TempliPhi™ 100 Amplification Kit

Bst DNA/RNA Polymerase

WarmStart® LAMP Kit (DNA & RNA)

También necesitaríamos SBYR Green I

Biopelículas: las ciudades de las bacterias

Los monocultivos líquidos y en las dos dimensiones de las placas Petri han sido el estándar de la microbiología hasta ahora. Fuente

Las enfermedades infecciosas agudas causadas por bacterias patógenas especializadas como la difteria, tétanos, peste, cólera o la tos ferina, que representaban la principal causa de muerte a principios del siglo XX, han sido controladas en la actualidad gracias a la acción de los antibióticos y de las vacunas. En su lugar, más de la mitad de las infecciones que afectan a pacientes ligeramente inmunocomprometidos son producidas por bacterias ubicuas, capaces de producir infecciones de tipo crónico, que responden pobremente a los tratamientos antibióticos y no pueden prevenirse mediante inmunización. 

Al ser bacterias ubicuas en el medioambiente son bacterias muy eficientes intercambiándose genes por transferencia horizontal, lo que además de infectar a pacientes inmunocomprometidos causan infinidad de problema al ser multirresistentes a los antibióticos usados en clínica. Ejemplos de estas infecciones son la otitis media, endocarditis de válvulas nativas, infecciones urinarias crónicas, infecciones de próstata, osteomielitis y todas las infecciones relacionadas con implantes (Costerton et al, 1995) 

El análisis directo de los implantes y tejidos de estas infecciones muestra claramente que en la mayoría de los casos la bacteria responsable de la infección crece adherida sobre el tejido o el implante formando comunidades de bacterias a las que se les ha denominado biopelículas. Dentro de la biopelícula, las bacterias están protegidas de la acción de los anticuerpos, del ataque de las células fagocíticas y de los tratamientos antimicrobianos. En este artículo se describe el papel que juegan las biopelículas en infecciones humanas persistentes (Davey et al, 2000)

El crecimiento en biopelículas representa la forma habitual de crecimiento de las bacterias en la naturaleza. Las biopelículas se definen como comunidades de microorganismos que crecen embebidos en una matriz de exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o un tejido vivo. 

Arquitectura de biopelícula de mutantes de LPS PAO1 de P. aeruginosa en metacrilato de sulfopropilo (carga negativa) y en vidrio, 72 horas después de la inoculación. Fuente

Aunque la composición de la biopelícula es variable en función del sistema en estudio, en general, el componente mayoritario de la biopelícula es el agua, que puede representar hasta un 97% del contenido total. Además de agua y de las células bacterianas, la matriz de la biopelícula es un complejo formado principalmente por exopolisacáridos. En menor cantidad se encuentran otras macromoléculas como proteínas, DNA y productos diversos procedentes de la lisis de las bacterias (Branda et al, 2005).

Estructura de una biopelícula: una "ciudad" de bacterias. Fuente

En los primeros trabajos sobre la estructura de la biopelícula, una de las cuestiones que surgía con mayor reiteración era cómo las bacterias del interior de la biopelícula podían tener acceso a los nutrientes o al oxígeno. Estudios realizados utilizando microscopía confocal han mostrado que la arquitectura de la matriz de la biopelícula no es sólida y presenta canales que permiten el flujo de agua, nutrientes y oxígeno incluso hasta las zonas más profundas de la biopelícula. La existencia de estos canales no evita sin embargo, que dentro de la biopelícula podamos encontrarnos con ambientes diferentes en los que la concentración de nutrientes, pH u oxígeno es diferente. Son auténticas ciudades de bacterias (Stoodley, 2002)

Composición típica de una biopelícula ¡Solamente un 2-5% de bacterias! (Sutherland, 2001)

¿Por qué combatir biopelículas desde una perspectiva "One Health"?

En un estudio previo hemos demostrado que bacterias que se encuentran en granjas en el área de Quito se van a encontrar más tarde en los hospitales de la ciudad (Medina-Santana et al, 2021, Ortega-Paredes et al, 2020). Una investigación que tenga como objetivo desarrollar estrategias para prevenir y tratar infecciones en  animales y granjas para evitar su dispersión posterior a hospitales, debe tener en cuenta las características únicas de los biofilms. Por lo tanto, necesitamos desarrollar protocolos de desinfección eficaces para la eliminación de las biopelículas en explotaciones y medios de procesado de alimentos, ya que los biofilms pueden actuar como reservorios de agentes infecciosos.

¿Por qué combatir biopelículas dentales?

Uno de los ejemplos más claros de cómo las biopelículas afectan a la salud de las personas son las biopelículas dentales. 

Surco gingival en donde crea biopelículas Porphyromonas gingivalis. Autor

De las bacterias bucales que causan problemas de salud destaca Porphyromonas gingivalis. Esta bacteria está presente en el 80% de las periodontitis (How et al, 2016). La prevalencia de las periodontitis es alta. En los EEUU afecta al 46% de la población de manera modera y al 8.9% en su forma severa (Eke et al, 2015). Recientemente, se ha demostrado que Porphyromonas gingivales está relacionada con el desarrollo del Alzheimer (Costa et al, 2021). Por estas razones, eliminar esta bacteria de la microbiota bucal sería de interés para mejorar la salud de la población.

Moléculas de Porphyromonas gingivalis implicadas en la formación de biopelículas. Las gingipainas son unas proteinasas que se han encontrado en los cerebros de pacientes con Alzheimer. Fuente Gerits et al, 2017.

Cuando hablamos de destruir bacterias automáticamente pensamos en los antibióticos. ¿Por qué es mala idea utilizar antibióticos para eliminar bacterias bucales? si eliminamos las bacterias los epitelios de la boca pueden ser colonizados por hongos. Si las biopelículas bacterianas son difíciles de combatir, prueba con la de los hongos. Además, la batería de antifúngicos es todavía más limitada que la de los antibióticos, por lo que de aparecer resistencias todavía se pondría más fea la cosa. La otra razón es que las bacterias que causan problemas bucales están en forma de biopelículas y éstas pueden ser hasta 500 veces menos sensibles a los antibióticos que las bacterias de vida libre (planktónicas) (Maezono et al, 2011). 

¿Cómo combatir biopelículas bacterianas?

Voy a poner dos ejemplo: mediante productos de síntesis orgánica contra Pseudomonas aeruginosa y también contra P gingivalis y  bacteriófagos anti-Salmonella. 

Se ha encontrado que el diclorocarbazol y moléculas basadas en 2-aminoimidazol y 2 aminobenzimidazole son activas contra las biopelículas de Pseudomona aeruginosa (Liebens et al, 2014). Estos compuestos también reducen la expresión de fimbrias en P gingivalis (Wright et al, 2014).  

Para saber más:

Branda SS, Vik S, Friedman L, Kolter R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol 2005; 13: 20-26    

Costerton JW, Lewandowski Z, Caldwell DE, Korber DR, Lappin-Scott HM. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol 1995; 49: 711-745       

Davey ME, O’Toole GA. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev 2000; 64: 847-867        

Stoodley P, Sauer K, Davies DG, Costerton JW. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol 2002; 56: 187-209  

Ian W Sutherland. The biofilm matrix – an immobilized but dynamic microbial environment. Trends in Microbiology 2001, Vol 9, 5: 222-227, doi.org/10.1016/S0966-842X(01)02012-1.

Medina-Santana, J. L., Ortega-Paredes, D., de Janon, S., Burnett, E., Ishida, M., Sauders, B., Stevens, M., & Vinueza-Burgos, C. (2021). Investigating the dynamics of Salmonella contamination in Integrated Poultry Companies using a Whole Genome Sequencing approach. Poultry Science, 101611. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.psj.2021.101611

Ortega-Paredes, D., de Janon, S., Villavicencio, F., Ruales, K. J., De La Torre, K., Villacís, J. E., Wagenaar, J. A., Matheu, J., Bravo-Vallejo, C., Fernández-Moreira, E., & Vinueza-Burgos, C. (2020). Broiler Farms and Carcasses Are an Important Reservoir of Multi-Drug Resistant Escherichia coli in Ecuador. Frontiers in Veterinary Science, 7. https://doi.org/10.3389/fvets.2020.547843

Gerits E, Verstraeten N, Michiels J. New approaches to combat Porphyromonas gingivalis biofilms. J Oral Microbiol. 2017 Mar 15;9(1):1300366. doi: 10.1080/20002297.2017.1300366. 

How KY, Song KP, Chan KG.Porphyromonas gingi-valis: an overview of periodontopathic pathogenbelow the gum line. Front Microbiol.2016;7:53.

Costa MJF, de Araújo IDT, da Rocha Alves L, da Silva RL, Dos Santos Calderon P, Borges BCD, de Aquino Martins ARL, de Vasconcelos Gurgel BC, Lins RDAU. Relationship of Porphyromonas gingivalis and Alzheimer's disease: a systematic review of pre-clinical studies. Clin Oral Investig. 2021 Mar;25(3):797-806. doi: 10.1007/s00784-020-03764-w. Epub 2021 Jan 20. PMID: 33469718.

Eke PI, Dye BA, Wei L, Slade GD, Thornton-Evans GO, Borgnakke WS, Taylor GW, Page RC, Beck JD, Genco RJ. Update on Prevalence of Periodontitis in Adults in the United States: NHANES 2009 to 2012. J Periodontol. 2015 May;86(5):611-22. doi: 10.1902/jop.2015.140520. Epub 2015 Feb 17. PMID: 25688694; PMCID: PMC4460825.

Liebens V, Gerits E, Knapen WJ, Swings T, Beullens S, Steenackers HP, Robijns S, Lippell A, O'Neill AJ, Veber M, Fröhlich M, Krona A, Lövenklev M, Corbau R, Marchand A, Chaltin P, De Brucker K, Thevissen K, Cammue BP, Fauvart M, Verstraeten N, Michiels J. Identification and characterization of an anti-pseudomonal dichlorocarbazol derivative displaying anti-biofilm activity. Bioorg Med Chem Lett. 2014 Dec 1;24(23):5404-8. doi: 10.1016/j.bmcl.2014.10.039. PMID: 25453797.

Maezono H, Noiri Y, Asahi Y, Yamaguchi M, Yamamoto R, Izutani N, Azakami H, Ebisu S. Antibiofilm effects of azithromycin and erythromycin on Porphyromonas gingivalis. Antimicrob Agents Chemother. 2011 Dec;55(12):5887-92. doi: 10.1128/AAC.05169-11. Epub 2011 Sep 12. PMID: 21911560; PMCID: PMC3232792.

Porphyromonas gingivalis, el Alzheimer y las gingipainas

El patógeno intracelular Porphyromonas gingivalis y la enfermedad de Alzheimer están relacionados. El grupo de Jan Potempa de la Universidad Kentucky en Louiville han detectado enzimas tóxicas llamadas gingipainas en el cerebro de pacientes con Alzheimer. Además, también encontraron esas gingipainas en cerebros de personas fallecidas que no fueron diagnosticadas con Alzheimer. Este punto es importantes por que el patógeno Porphyromonas gingivalis y el Alzheimer se habían relacionado, si, pero no se sabía si la enfermedad de las encías provoca Alzheimer o si es la demencia la que conduce a un cuidado bucal deficiente. Ahora, el hecho de encontrar gingipainas en personas que nunca fueron diagnosticadas de Alzheimer nos indica que esto es previo a la enfermedad, que se podría haber desarrollado si hubiesen vivido más tiempo.

Que tengas P gingivalis en la boca está asociada con el Alzheimer. (Foto: Wikimedia)

El Alzheimer no está relacionado con el virus del herpes

El grupo de Zhandong Liu del Baylor College Medicine publicaron en la revista Neuron, analizaron secuencias del virus a gran escala y el resultado es que no existe vínculo entre la abundancia de ADN o ARN viral del herpes y la probabilidad de padecer la enfermedad de Alzheimer en la cohorte de los tejidos cerebrales post-morten con Alzheimer que fue analizado en 2018. En este estudio se observó que los niveles del herpesvirus humano 6A (HHV-6A) y del herpesvirus humano 7 (HHV-7) en los tejidos cerebrales 'postmortem' de más de 1.000 pacientes con enfermedad de Alzheimer, comparados con los de cerebros de personas que no habían desarrollado la infermedad. Al reanalizar los datos vieron que no hay vínculo entre la abundancia de ADN o ARN viral del herpes y la probabilidad de padecer alzhéimer

Fuente

Porphyromonas gingivalis y el alzhéimer

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Porphyromonas gingivalis y su posible relación con la enfermedad de Alzheimer

P. gingivalis gingipains en rojo entre las neuronas de un paciente con Alzheimer. Fuente Cortexyme

En los últimos años, hay cada vez más artículos científicos apoyando la hipótesis de que el Alzheimer es una infección. Jan Potempa, de la Universidad de Louisville, ha revelado la presencia de Porphyromonas gingivalis, una de las bacterias que producen la gingivitis, en cerebros de pacientes muertos por Alzheimer.

Esta no es la primera vez que tenemos pruebas de que esta bacteria podría estar relacionada con esta enfermedad neurodegenerativa. En dos experimentos realizados por separado por la startup farmacéutica Cortexyme, vieron que si se infectaban ratones con la bacteria patógena, se observaba colonización del cerebro por la bacteria, lo que originaba un incremento en la producción de la proteína amiloidea beta, que es la proteína asociada con el Alzheimer. Sin embargo, según el autor de este trabajo, Stephen Dominy, todavía no tienen la prueba definitiva de que la bacteria causa Alzheimer, aunque las pruebas presentadas parecen ser prometedoras.

Este grupo de investigación ha descubierto también unas enzimas tóxicas llamadas gingipains secretadas por la bacteria en los cerebros de los pacientes con Alzheimer. Estas proteínas, en los cerebros infectados colocalizan con otras dos proteínas características del Alzheimer: la proteína Tay y la ubiquitina. Las gingivinas se han encontrado también en los cerebros de pacientes muertos pero que nunca han sido diagnosticados con Alzheimer.

Todavía no tenemos la prueba definitiva

A pesar de lo prometedor de estos descubrimientos todavía no se ha presentado la prueba definitiva que nos diga que las gingipains causan Alzheimer. En ciencia es importante establecer una causa efecto. Podría ser que muchos pacientes con Alzheimer descuiden su limpieza buca y por ese motivo se colonicen por P. gingivalis y la presencia de la bacteria y de los gingipains sean resultado de la falta de higiene.

Mientras esperamos por la prueba definitiva, la compañía Cortexyme está probando un nuevo producto, el COR388, el cual está ya siendo probado en ensayos clínicos en pacientes de Alzheimer. Este producto en ratones ha demostrado disminuir la carga bacteriana y reducir la producción de la proteína amiloidea beta y la neuroinflamación.

En las encías que sufren gingivits puede vivir la bacteria Porphyromonas gingivalis